室内新风空气净化系统微生物多样性研究

殷欣，孟艺伟，赵丽娅，齐君，夏雪奎，高翠玲

(1. 齐鲁工业大学(山东省科学院)山东省科学院生物研究所，山东 济南 250103; 2. 山东省产品质量检验研究院，山东 济南 250102)

室内空气环境质量与城市人群健康密切相关。成年人约80%～90%的时间是在室内度过的，而在城市中一些行动不便的老人、婴儿等在室内的时间可能高达95%[1]。室内空气若发生微生物污染，易引起人们(特别是免疫力低下的老人和婴幼儿)出现头疼、呼吸道感染[2]、恶心、过敏、皮炎等症状。形成室内空气细菌污染的原因一般是通风不好，并且室内人员较多，更容易滋生致病微生物。此外，室内通风系统的微生物污染也是导致室内微生物超标的重要原因[3]。因此，研究室内空气的微生物群落结构变化将对人们的身体健康起到警示和保障作用。

传统的微生物鉴定方法，主要通过将微生物培养后依据形态学、生理生化反应、生态学特征等进行鉴别。Orji等[4]指出这种方法只能检测出约1%的重要病原菌，而利用宏基因组学、高通量测序、系统发育树分析等技术，自然界中100%的致病菌都能得到研究。随着基因测序技术的发展，16S rDNA扩增子测序技术的应用越来越广泛，已成为研究大气、水、油井等环境样品中细菌群落结构的重要手段[5-7]。

随着人们对空气质量与健康关系认识地不断加深，如何将室内空气中的杂质去除以提高空气质量也受到研究者的关注。Zhao等[8]通过多级过滤去除了室内空气中大量的灰尘、微生物等杂质，从而提高了空气质量。近年来，国内越来越多的新风空气净化系统进入到各种场所，如商场、医院、幼儿园、家庭等。然而新风系统的兴起时间较短，人们对于该系统的认识还不够全面，例如是否能够高效净化空气，保障室内空气的持续高质量而不引发空气的二次污染等。目前针对室内新风空气净化系统，利用测序技术对其微生物群落结构进行研究，从而探讨室内空气的微生物群落结构变化的相关文献还未见报道。本文收集了在济南历城地区使用的新风系统空气滤膜所积累的微生物为样本，利用16S rDNA扩增子测序技术进行细菌丰度检测，以期掌握该地区室内细菌的主要组成成分，并分析潜在的细菌污染风险。

1 材料与方法

1.1 材料

济南市历城区某全国连锁幼儿园，截至2018年11月31日使用了不同时间的新风系统中的超细玻璃纤维空气滤膜，分为3个样本组，每个样本组含有3个重复样本(表1)。所有样本装入无菌采样袋中，在4 ℃条件下运输至实验室，4 h内处理。

表1 不同使用时间的空气滤膜样本编号Table 1 Numbers of air-filtration membrane samples used in different time

1.2 样本处理

(1)每个样本取15～20片空气滤膜剪碎，分装入含有0.9%生理盐水的50 mL无菌离心管中，4 ℃，200 g离心2 h；(2)轻轻涡旋，用0.22 μm MCE微孔滤膜(货号：F513134-0001-生工)过滤；(3)收集微孔滤膜，剪碎后用于提取样本的宏基因组DNA。DNA提取采用DNeasy Power Soil Kit(货号：12888-50-QIAGEN)。

1.3 16S rDNA扩增子测序

各样本的宏基因组DNA用无菌水稀释至终浓度1 ng/μL，并以此为模板，利用16S V3-V4区通用引物(F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′和R：5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)进行PCR扩增[9]。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳检测并回收后，使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建库试剂盒(Thermofisher公司)构建宏基因组文库，经过定量和检测后进行高通量测序，测序方法为单端测序(single-end)法。

1.4 测序数据处理

使用Cutadapt v1.9.1先对reads进行初步处理得到原始数据(raw reads)，然后进行去除嵌合体序列的处理，得到有效数据(clean reads)。利用Uparse v7.0.1001对所有样品的全部有效数据进行聚类，默认以97%的一致性(identity)将序列聚类成为操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)，同时会选取OTU的代表性序列，依据其算法原则，筛选OTU中出现频数最高的序列作为代表序列；对OTU序列进行物种注释，用Mothur方法与SILVA132[10]的SSUrRNA数据库进行物种注释分析(设定阈值为0.8～1.0)，获得分类学信息并分别在各个分类水平：kingdom(界)，phylum(门)，class(纲)，order(目)，family(科)，genus(属)，species(种)统计各样本的群落组成；使用MUSCLE v3.8.31软件进行快速多序列比对，得到所有OTU序列的系统发生关系[11]。最后对各样品的数据进行均一化处理，后续分析都是基于均一化处理后的数据。

2 结果与讨论

2.1 测序数据分析

16S rDNA扩增子测序得到的有效数据数目在45 878～64 178范围内，平均长度395～415 nt，有效数据中碱基质量值大于20(测序错误率小于1%)的碱基所占的百分比(Q20)超过82%，数据得率90%以上。3个样本组的测序深度均超过99.9%，理论上测序数据已覆盖样本中的全部序列。

2.2 OTUs聚类分析

在97%相似性水平上进行聚类，3个样本组共有OTU数量达1015个，样本组JN6，JN9和JN12特有的OTU数量分别为303，484和274个(图1)。基于OTU的物种分类分析，细菌种类覆盖31个门725个属。其中，样本组JN9中特有的OTU数目最多，预示含有较多的特有微生物种类。

图1 OTU维恩图Fig.1 Venn diagram of OTU

2.3 门水平Top10物种相对丰度及优势物种差异分析

对OTU的代表序列进行物种注释，根据物种注释结果，选取3个样本组在门(phylum)分类水平上最大丰度排名前10的物种进行物种相对丰度和优势物种差异分析(图2)，结果显示各样本中以变形菌门(Proteobacteria)(占比27%～54%)、厚壁菌门(Firmicutes)(占比13%～30%)、放线菌门(Actinobacteria)(占比12%～30%)和拟杆菌门(Bacteroidetes)(占比4%～10%)的微生物居多，4种细菌门总丰度平均为90%。许多对人体有害的微生物如大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、幽门螺杆菌、脑膜脓毒性金黄杆菌、结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌等都属于这些种类[12-13]。在生活环境中，变形菌门细菌比较常见，即使经过消毒杀菌，其再生能力仍然较强[14]。厚壁菌门细菌即使处于一些抗生素环境中也具有较强的生命力[15]。放线菌中绝大多数是有益菌，也有极少数会引起人类的疾病。拟杆菌门的一些细菌可以释放细胞神经毒素从而使人体发生炎症性神经变性，甚至已经可以作为某些环境下的污染指标[16-17]。随着使用时间的增加，3个样本组中变形菌门、厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门这4类菌之间的丰度比例相对变化不明显，但总丰度由85%上升至95%，分析可能是该地区空气中微生物群落结构长期变化不大，且持续污染程度较严重，使得空气中微生物含量丰富导致的这种现象，所以该地区室内新风空气净化系统滤膜中致病菌存在的可能性较大，可能会出现微生物的二次污染情况。

图2 门水平上Top10物种相对丰度柱形图Fig. 2 Bar chart of relative abundance of top 10 species at phylum level

2.4 属水平Top100物种系统进化关系及Top10物种相对丰度分析

变形菌门、放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门中所含菌属种类明显居多(图3)。在3个样本组中，甲基杆菌属(Methylobacterium)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、副球菌属(Paracoccus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、莱茵海默氏菌属(Rheinheimera)、不动杆菌属(Acinetobacter)和蓝细菌属等为优势菌属(图3)。其中，甲基杆菌属、双歧杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、芽孢杆菌属、不确定蓝细菌属的微生物一般是室内经常检出的优势菌群[18]。此外，样本组JN12中还特别富含莱茵海默氏菌属、乳杆菌属(Lactobacillus)和不动杆菌属的微生物(图4)。其中不动杆菌属中一些微生物是条件致病菌，如鲍曼不动杆菌，该菌是临床上最常见的一种条件致病菌，通常会引起腹膜炎、骨髓炎、关节炎、菌血症和肺炎等[19]。Wu等[20]利用16S rDNA高通量测序技术对奶粉生产线室内空气进行了微生物多样性检测，也发现鲍曼不动杆菌、蜡样芽胞杆菌、科氏葡萄球菌等一些致病菌。由于JN12中不动杆菌属微生物占有较高的丰度，因此推测该地区的空气净化系统在使用12个月时存在微生物二次污染的风险，应当引起居民的注意。

图3 属水平上Top10物种相对丰度柱形图Fig. 3 Bar chart of relative abundance of top10 species at genus level

分支和扇形的颜色表示其对应的门；扇环外侧的堆积柱形图表示该菌属在不同样本中的丰度分布信息。图4 属水平Top100物种系统发生关系Fig.4 Top100 species phylogenetic relationships at genus level

2.5 不同使用时间对优势物种的影响

通过分析3组样本组之间的优势菌属和种的差异(图5)，我们在属和种分类水平下，选取平均丰度排名前10的物种，生成三元相图(ternary plot)。由图5(a)可知，随着空气滤膜使用时间的延长，微生物的菌属优势也在发生变化，逐渐由不确定蓝细菌属、双歧杆菌属和鞘氨醇单胞菌属向芽孢杆菌属、副球菌属过渡，最后不动杆菌属和莱茵海默氏菌属微生物占绝对优势。在种水平上(图5(b))，从使用时间6个月到12个月，由Loliumperenne，Methylobacteriumaquaticum，Bambusaoldhamii和Pelomonaspuraquae向Sphingomonasphyllosphaerae，Bifidobacteriumadolescentis，Moraxellaosloensis，Clostridiumpapyrosolvens和Kocuriarosea过渡，最后Acinetobacterjohnsonii占绝对优势。其中，使用时间为9个月的样本中含有奥斯陆莫拉氏菌(Moraxellaosloensis)。该菌为条件致病菌，可引起临床上原发性和继发性感染，如结膜炎、中耳炎、脑膜炎、肾炎、支气管炎和关节炎等[12,21]。以上结果预示着该地区的室内空气中存在着一些致病菌，通过新风空气净化系统过滤后累积于滤膜上，若滤膜的使用时间过长，容易发生微生物二次污染，影响居民的身体健康。

图5 样本的优势属和种的差异Fig. 5 Differences of dominan tgenus and species in samples

3 结论

采用高通量测序技术对样本16S rDNA片段进行测序，可以获得准确的序列信息和更大的数据量，从而在后续分析中获得更加深入、全面和可靠的结果。将此技术引入室内空气净化系统的细菌多样性分析中，可以提供更加详实准确的信息。通过分析济南市历城地区室内新风净化系统随着使用时间的延长室内空气中微生物群落结构的变化，发现该地区室内空气中微生物含量较丰富，群落结构长期变化不大，并且空气中存在条件致病菌，如奥斯陆莫拉氏菌等。该地区室内新风空气净化系统使用12个月时存在一定的微生物二次污染风险。