基于网络药理学探讨葶苈大枣泻肺汤治疗新冠肺炎的作用机制

刘京华，谭旺晓，王斯维，王雨，王小莹

(天津中医药大学，天津 301617)

2019年暴发的新冠肺炎(COVID-19)，具有显著的传染性，目前已成为全球性问题[1-2]。在COVID-19治疗早期以中医药干预为主，通过中西医结合的治疗方针，能够充分发挥中医药在疫情防治中的作用[3]。

中医理论辩证COVID-19的发病机制为湿邪致病，初期表型为寒湿，中期以湿阻肺脾证和湿热蕴肺证最为常见，后期多表现为气阴两虚证和肺脾气虚证[4]。由COVID-19诊疗方案的中医分期病机特点可知，在使用频次超过两次的17味中药中，葶苈子居于止咳平喘药的首位[5]，发挥药效的主要成分为葶苈子中的芥子苷与β-谷甾醇。研究报道，β-谷甾醇具有舒张支气管平滑肌及祛痰作用[6]。现代药理学研究表明，葶苈子具有较强的利尿作用，与杏仁、大黄配伍可用于治疗胸胁积水[7]；还具有广谱抗菌作用[8]，可通过抗炎与抗氧化作用来保护心肌细胞免受损伤，从而起到保护心脏作用[9]。COVID-19疫情发生以来，复方药在抗疫方面起到重要的作用，曹新福等[10]报道葶苈子与石膏配伍在防治COVID-19用药中的置信度最高，而葶苈大枣泻肺汤是由葶苈子和大枣组成的中药复方。北宋《开宝本草》述该药“疗肺壅上气咳嗽，止喘促，除胸中痰饮”[8]。清代名医张璐在《千金方衍义》中指出“葶苈破水泻肺，大枣护脾通津，乃泻肺而不伤脾之法，保全母气以为向后复长肺叶之根本”[11]。葶苈子具有入肺泻气和开结利水之功效，可使肺气通利，痰水下引，进而喘可平，肿可退[12]。大枣的作用主要是保护肺气，防止药物对患者肺气有损伤，提高治疗的安全性[13]。葶苈大枣泻肺汤临床上主要用于病毒性肺炎、肺心病、结核性胸腔积液的治疗，且应用效果已经得到了多方认证[14-15]。

中药具有多成分、多靶点、系统调节的作用特点，但由于其成分复杂，作用靶点众多，很难完全阐明其作用机制。网络药理学的整体性、系统性与中医药的整体观、辨证论等基本理论趋于一致[16]，在药物靶点鉴定、有效成分发现、作用机理研究、临床前研究等领域具有广泛的应用价值[17]，其主要通过对复杂的疾病网络进行协同调节，以交互式的网络调控方式来研究整体的病理进展。基于中药成分数据库及其与靶点、疾病之间的相关信息构建药材-成分-靶点-疾病网络模型[18]，能够揭示其内在联系，对中药提高靶标疗效具有指导意义。

本研究基于网络药理学探讨葶苈大枣泻肺汤治疗COVID-19的潜在作用靶点与信号通路，主要运用中药系统药理学分析平台(TCMSP)、The Human Gene Database(GeneCards)等数据库收集葶苈大枣泻肺汤治疗 COVID-19 的相关靶点，并运用相关数据库进行靶点功能、通路的预测，为进一步研究葶苈大枣泻肺汤潜在治疗 COVID-19 的药理作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 葶苈大枣泻肺汤主要活性化合物的筛选

口服生物利用度(OB)表示有效成分或活性基被吸收到达体循环并被吸收的速度与程度，OB 值越高通常表示药物的生物活性分子的类药性(DL)越好。本研究以葶苈子、大枣两味中药为关键词，以OB≥30%、DL≥0.18 为筛选参数，利用TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)检索中药的主要活性化合物。

1.2 葶苈大枣泻肺汤主要作用靶点和相关疾病靶点的收集

通过TCMSP搜索方中主要活性化合物的相关靶点，运用GeneCards(https://www.genecards.org/)数据库检索与COVID-19相关的基因。通过分析，得到葶苈大枣泻肺汤与COVID-19的共同靶点蛋白。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络、化合物-靶点-疾病网络的构建

将葶苈大枣泻肺汤的主要活性化合物、靶点通过STRING数据库(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins，https://string-db.org/)和 Cytoscape3.6.1 软件(http://www.cytoscape.org/)构建靶标PPI网络、药物-化合物-靶点网络。

1.4 靶点通路分析

将上述筛选得到的药物与疾病相关的靶点输入Metascape数据库(http://metascape.org/gp/index.html/main/step1)，通过输入靶基因名称列表并选定物种为“homo sapiens”，进一步点击Custom analysis设置参数分析，选择GO与KEGG富集分析。

1.5 分子对接

为进一步分析葶苈大枣泻肺汤对于COVID-19 的干预作用，我们将药物靶点中化合物度值较高的前十种与ACE2进行分子对接。对接方法如下：

(1)小分子和蛋白的处理：使用Sybyl 2.0软件构建中药单体小分子化合物，并对化合物的结构进行能量优化，存为mol2文件。从PDB(protein data bank)数据库中下载ACE2的蛋白晶体结构，蛋白ID为1R4L，利用Sybyl 2.0软件提取出蛋白中的配体，将无配体蛋白和配体分别保存为PDB文件。

(2)分子对接：通过混合Lamarckian遗传算法(LGA)进行对接。在Autodock 4.2软件中打开无配体蛋白文件，并为其加入电荷。通过配体文件的位置确定蛋白晶体的结合域，在结合域处设定结合晶格，晶格的xyz轴均为40格点。将小分子mol2文件加入电荷成为pdbqt文件，使用该文件在结合晶格处与蛋白进行虚拟对接。算法设定为遗传算法(genetic algorithm，GA)，四元数(quaternion)与小分子旋转键扭转次数(torsion)都为30次，运行次数为30轮次，其他设定均为默认值。

(3)对接结果分析：将对接结果按照结合能绝对值进行排序，选取结合能绝对值最高的构象，使用Pymol软件对结合位点进行可视化分析。

2 结果

2.1 葶苈大枣泻肺汤主要活性化合物

通过TCMSP检索，设置参数OB≥30%、DL≥0.18共筛选出主要活性化合物27个，其中大枣15个，葶苈子12个。按照OB值大小排列，表1为葶苈大枣泻肺汤的活性成分。

表1 葶苈大枣泻肺汤活性化合物基本信息Table 1 Basic information on active compounds of Tingli Dazao Xiefei decoction

续表1

2.2 药物-化合物-靶点网络

将表1中27个主要活性化合物通过TCMSP数据库预测主要活性成分调控靶点，去除重复值，共得到224个靶点。运用Cytoscape软件构建药物-化合物-靶点网络(图1)，该网络总共有19个节点和452条边。其中葶苈子所调控的相关靶点主要与细胞凋亡、炎症与氧化应激相关，而大枣所调控的靶点主要参与炎症反应，二者联用在突出调控炎症反应的同时，也具有调控氧化应激及细胞凋亡等方面的作用。分析结果表明，葶苈子与大枣共同调控的靶点有45个(图2)，其中排名靠前的靶点主要有：前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、前列腺素G/H合酶1(PTGS1)、钠通道蛋白5亚单位α(SCN5A)、cAMP依赖性蛋白激酶催化亚单位α(PRKACA)、γ-氨基丁酸受体亚单位α-1(GABRA1)，主要参与调控机体的炎症反应。因此两药共同作用时，能够在抗炎方面发挥协同增效的作用。

图1 药物-化合物-靶点网络调控图Fig.1 The regulation diagram of compound-target-pathway network

图2 葶苈-大枣共同调控靶点网络图Fig.2 The targets′ network diagram coregulated by Tingli and Dazao

通过拓扑分析参数表(表2)来观察药物的主要活性成分调控的作用程度。由化合物所对应靶点的边数得知，排名前十的药物成分主要有槲皮素、山奈酚、小檗碱、异鼠李素、β-谷甾醇等，这些成分可能是葶苈大枣泻肺汤的主要活性成分。

表2 药物-化合物-靶点网络拓扑分析参数表Table 2 Compound-target-pathway network topology analysis parameters

2.3 预测葶苈大枣泻肺汤治疗COVID-19的靶点

根据GeneCards数据库检索COVID-19的靶点，得到251个相关靶点。运用Venn平台将葶苈大枣泻肺汤的靶点与 COVID-19 的治疗靶点取交集，得到39个共同靶点，见图3。

图3 葶苈大枣泻肺汤治疗新型冠状病毒肺炎靶点Venn图Fig.3 Venn diagram of the targets of COVID-19 treated with Tingli Dazao Xiefei decoction

2.4 葶苈大枣泻肺汤与COVID-19 PPI网络的构建

图3得到的39个靶点在STRING平台进行PPI网络分析，核心网络图(图 4)包含39个节点，394条边，其中节点表示蛋白，每条边则表示蛋白与蛋白之间的相互作用关系，线条越多表示关联度越大。靶蛋白平均节点度值为20.2，超过平均度值的靶蛋白有20个，说明这20个靶蛋白是PPI网络中的关键靶点，提示葶苈大枣泻肺汤可能通过调节这些靶点发挥治疗COVID-19的作用。20个关键靶点依据度值由高到低排序，其与炎症疾病相关的主要靶点有:肿瘤坏死因子(TNF)、丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、C-C基序趋化因子2(CCL2)等。结果见表 3。

图4 葶苈大枣泻肺汤与COVID-19 PPI网络图Fig.4 Protein-protein interaction network diagram of Tingli Dazao decoction and COVID-19

表3 葶苈大枣泻肺汤 PPI 网络中大于平均度值的靶标蛋白Table 3 Target proteins with above-average values in PPI network of Tingli Dazao Xiefei decoction

2.5 葶苈大枣泻肺汤靶点通路分析

将39个靶点上传到Metascape数据库中，进行GO富集分析和KEGG通路注释，共得到分子功能、生物过程和细胞成分GO条目232个，KEGG富集通路146条。根据P值分别得到排名前20富集柱状图(如图5(a)、6(a)所示)。同时，根据相关度进行群集ID着色，如图5(b)和6(b)，颜色区分不同类别，且节点面积与聚集程度成正相关。将所有靶点进行全连接网络交互，得到图5(c)、6(c)，不同颜色表示互作网络中可识别到的子模块，且节点面积与富集分析的频次成正比。

通过分析发现，GO功能富集主要涉及凋亡信号途径、外部刺激反应的正向调节、对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、细胞因子介导等。根据网络交互显著性分析，得到子模块如图5(d)所示，细胞肿瘤抗原p53(TP53)、丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、MAPK8等为关键作用靶点，在GO富集中起到重要作用。

图5 葶苈大枣泻肺汤靶点的 GO 富集分析及相关网络图 Fig.5 GO enrichment analysis and network diagram of targets regulated by Tingli Dazao Xiefei decoction

KEGG通路注释主要参与调控IL-17、NF-κB、甲型流感、肺结核等信号通路，其中在 AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications，Chagas disease (American trypanosomiasis)，Leishmaniasis，Hepatitis B，Toxoplasmosis五条通路上靶点富集较多。根据网络交互显著性分析，得到子模块如图6(d)所示，TP53，MAPK1，MAPK14等为关键作用靶点，在治疗新型冠状病毒肺炎中起到药效作用。

图6 葶苈大枣泻肺汤治疗 COVID-19 的 KEGG 富集分析及相关网络图Fig.6 KEGG pathway analysis and network diagram of Tingli Dazao Xiefei decoction for the treatment of COVID-19

2.6 葶苈大枣泻肺汤活性成分以及临床用药与ACE2对接结果分析

Lopes等[19]报道血管紧张素转换酶-2(ACE2)是一种促进冠状病毒进入细胞的蛋白质。Willcox等[20]报道 COVID-19与ACE2结合，促进人体感染。张勇刚等[21]对结肠上皮细胞单细胞进行测序分析，结果表明共有5556个基因能够被ACE2表达。本研究对ACE2的表达基因进行分析，发现其中有60个基因能够受到葶苈大枣泻肺汤的调控，提示葶苈大枣泻肺汤可能通过作用于ACE2，进而对相关基因进行调控。因此在本研究中，对葶苈大枣泻肺汤中药主要有效成分进行分析，并按照拓扑分析将度值排名前十的成分采用分子对接的方法与ACE2受体的结合能进行预测，发现其均与ACE2具有较好的结合效果。我们对靶点度值前4的成分进行Pymol可视化分析，其中槲皮素、山奈酚、异鼠李素与ACE2具有共同的结合位点GLU-406；β-谷甾醇的结合位点为ARG-514；槲皮素的结合位点GLU-375也已被证明为ACE2的活性位点。因此推测葶苈大枣泻肺汤可通过以上位点与ACE2进行结合，从而抑制病毒与ACE2间的相互作用，为葶苈大枣泻肺汤的后续研究提供理论基础。主要药物成分与ACE2受体的结合能见表4，用PyMOL软件显示的药物主要活性成分与ACE2(PDB为1R4L)的分子对接3D图谱见图7。

表4 主要药物成分与ACE2受体的结合能表Table 4 Binding energy analysis of main components with ACE2 receptor

图7 药物主要活性成分与ACE2的分子对接3D图谱Fig.7 3D image of main active components binded with ACE2 receptor

3 讨论

COVID-19属于中医理论的“温病”范畴，其表现为外感温邪，以发热为主症，易化燥伤阴，易内陷生变，具备温邪致病的特性[22]。病机表现为“湿、热、毒、瘀、虚”[23]，由瘟疫论解析可知，其发病突然，具有一定的传染性及特异性[24]。在防疫期间COVID-19诊疗方案里含有葶苈子的处方药所对应的症状分别有：寒湿郁肺症、湿毒郁肺症、疫毒闭肺症、气营两燔症。而葶苈大枣泻肺汤中君药为葶苈子，因此探究其对于COVID-19的潜在防疫作用，可以为当前的抗疫工作提供一定的基础支持。

葶苈大枣泻肺汤组方由葶苈子和大枣组成，葶苈子味苦、辛，具有破坚逐邪、通利水道的作用，治疗咳嗽气喘。为防葶苈子性猛峻泻而伤正气，故佐以大枣，安中以缓和药性[25]。现阶段药理研究中，葶苈子具有止咳平喘、抗菌、抗炎、调血脂等药理作用[7]，大枣具有抗氧化、提高免疫、保护肝脏等作用[26]，葶苈大枣泻肺汤治疗肺炎的主要疗效成分与靶点尚不明确。本文利用网络药理学的方法，以中药有效成分和药物靶标为研究对象，预测药物所对应的靶点与通路，探讨葶苈大枣泻肺汤对于COVID-19的潜在靶标疗效意义。

本研究筛选得到葶苈大枣泻肺汤的主要活性成分 27 个，通过药物靶点分析得到，槲皮素、山奈酚、小檗碱、异鼠李素等化合物对应靶点的关联度较高。槲皮素具有抗病毒、减轻肺脏炎症、抗氧化等作用，可通过抑制JAK2/STAT3信号通路激活而改善气体交换功能，抑制炎性介质的释放，从而减轻LPS诱导的急性肺损伤[27]。山奈酚具有抗炎、抗菌、免疫调节、疾病预防等作用[28]，可明显改善小鼠肺组织X线照射后的炎性渗出，对放射性肺损伤具有一定的防治作用，并可降低炎性因子TNF-α，IL-6的释放，抑制NF-κB和MAPK通路的激活，进一步阻止炎性因子的生成，最终通过抗炎、抗氧化作用减少组织损伤[29]。大枣中的成分小檗碱可抑制细胞 TLR4/MyD88 依赖型信号通路，进一步抑制 NF-κB 激活，显著减少 NLRP3 炎症小体的表达，从而达到一定的抑制炎症反应作用[30]。综上所述，预测葶苈大枣泻肺汤可由其主要活性成分调节肺部疾病，并进一步调控炎症反应，达到协同增效的作用，预测其可通过抑制炎症反应对COVID-19达到一定的辅助治疗效果。

通过网络药理学分析发现，有45个靶点受到葶苈子与大枣的共同调控，主要涉及对NF-κB，p38/MAPK及JAK2/STAT3等信号通路的抑制，提示葶苈子与大枣配伍使用能够通过以上靶点发挥对炎症反应的抑制作用。大枣中的主要成分小檗碱还能够抑制炎症小体NLRP3的表达，与葶苈子配伍后，能够从不同角度发挥抗炎作用，增强药物的抗炎效果，发挥协同增效的作用。尽管已有研究证实葶苈子具有一定的抗炎作用，但其主要通过利水功效减轻肺部损伤[31]。由于葶苈子的药效过猛，对机体的正气具有一定的损伤，大枣药性温和，可缓和葶苈子的药性，保护心脾[32-33]，二者配伍使用，在改善机体功能的同时[34]，还能增强抗炎的效果，从而对炎症风暴的产生具有一定的抑制作用，对COVID-19发挥防治功效。

同时对得到的活性成分进行靶点预测，发现葶苈大枣泻肺汤中发挥主要作用的靶点有39个，经PPI网络分析发现葶苈大枣泻肺汤干预COVID-19发挥主要作用的靶点为TNF，CASP3，MAPK8，MAPK1，CCL2等。TNF可通过提高白细胞的吞噬能力、氧化爆发和释放蛋白酶来加强其对入侵微生物的杀伤作用，在SARS-CoV感染者急性期血清中 TNF水平与对照组比较显著增高，感染控制后TNF有所下降，说明TNF与肺部感染的发病有关[35]。MAPK1和MAPK8是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族成员，MAPK通路在控制炎症反应和免疫反应的诱导和调节中具有重要作用[36]，据报道MAPK信号通路是病毒RNA合成中高效输出病毒NP所必需的，抑制该通路则可减少流感病毒的复制和炎症症状[37]。此外当病原体攻击机体时MAPKs与炎症细胞因子和趋化因子的表达密切相关，其中趋化因子 CCL2能够特异性地趋化嗜酸性粒细胞聚集到气道黏膜表面，引起支气管上皮组织的损伤[38]。综上所述，葶苈大枣泻肺汤中关键成分可能通过调控TNF，MAPK，CCL2等靶点而发挥抗炎作用，保护肺损伤，从而辅助治疗COVID-19。

研究报道COVID-19病理检查发现肺组织有水肿、蛋白样渗出物、局灶性反应性肺细胞增生伴斑片状炎性细胞浸润[39]。由此说明当组织受到损伤或者感染，炎症反应是机体抵抗病原体的常见方式之一，有助于加强机体对病毒的清除作用[40]。促炎和抗炎机制的平衡对于维持机体免疫稳态至关重要[41]，若机体从“自我保护”演变为“过度保护”的状态，打破炎症反应的平衡状态，使免疫细胞产生正反馈反应进而诱导大量的促炎因子TNF-α，IL-1β，IL-8等的生成，可触发机体导致过度炎症反应即细胞因子风暴，短时间内大量产生炎症因子并对组织、器官造成严重病理损伤[42]。因此探索葶苈大枣泻肺汤对炎症相关通路的调节作用，及防止细胞因子风暴的产生具有重要意义。

本研究进一步对有效靶点分别进行GO与KEGG富集分析，得到GO条目232个，KEGG通路146条，GO富集分析结果显示靶点主要富集在凋亡信号途径、外部刺激反应的正向调节、脂多糖应答等。KEGG通路结果显示，葶苈大枣泻肺汤主要涉及IL-17信号通路、NF-κB 信号通路、肺结核等。IL-17信号通路在自身免疫和感染中诱导病理变化，可通过MAPK与NF-κB等途径诱导炎症因子IL-1β，IL-6，TNF的产生并协同加重炎症损伤[43]，在中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的血清中检测出IL-17，IL-6含量明显增高[44]，其中IL-6是诱发炎症风暴的重要通路，当机体的炎症平衡状态被打破，免疫系统在杀死病毒的同时，也会杀死大量肺的正常细胞，严重破坏肺的换气功能，从而产生“白肺”[45]。表明细胞因子风暴与疾病严重程度相关，另外IL-17通路的激活对脓毒症引起的肺部炎症起关键作用[46]。NF-κB作为一种涉及炎症介质产生、细胞增殖、细胞外基质交联和细胞凋亡转录因子，参与了多种炎症反应的信号转导过程[47]。研究报道重症支气管肺炎组的NF-κB表达水平均显著高于空白对照组，同时，其上游PI3K/AKT的磷酸化刺激NF-κB的活性增强，产生二聚体入核，从而调控炎症因子的合成和释放，导致血浆中的趋化因子和细胞因子处于动态变化水平，与肺组织病理损伤息息相关[48]。综合上述研究结果，预测葶苈大枣泻肺汤具有抑制促炎因子的表达，减轻肺部炎性损伤的潜在机制，还可通过调节炎症相关信号通路来抑制细胞因子风暴的爆发，可为进一步防治COVID-19提供一定的基础支持。

ACE2受体是一种可溶性的重组蛋白，药物成分与之结合后，可以抑制病毒与其活性部位相结合，从而防止病毒的传播[49]。分子对接结果显示，葶苈大枣泻肺汤中的主要活性成分与ACE2受体的结合能均远小于-25.10 kJ/mol，提示以上成分均与ACE2具有较好的结合效果。由此可见，药物活性成分与该受体结合较为稳定，推测葶苈大枣泻肺汤可通过与ACE2受体结合，从而抑制病毒与ACE2间的相互作用，进而存在潜在地治疗COVID-19的作用。排名前十的成分中6种来源于葶苈子，分别为：β-谷甾醇、蛇床子素、豆甾醇、槲皮素、山奈酚与异鼠李素；另外4种来源于大枣，分别为：(S)-椰油碱、斯特法林、香豆素、小檗碱。表明葶苈子与大枣中的成分均与ACE2具有一定的结合能力，可共同作用于机体，进而发挥治疗COVID-19的作用。

综上所述，本文通过网络药理学的方法，预测葶苈大枣泻肺汤对于COVID-19潜在的治疗靶点及调控通路，得到葶苈大枣泻肺汤具有潜在抑制机体产生炎症风暴的作用。本研究为葶苈大枣泻肺汤治疗COVID-19的药效机制研究提供了初步的预测，其确切的机制仍需后续的实验研究验证。