荷梗对慢性应激小鼠的抗抑郁作用及其对TPH2 和β CaMKII 表达的影响

张延红 曹亚飞 赵亚男 平 鑫 张少丹 裴 林

（1.河北中医学院， 河北 石家庄050031； 2.华北理工大学中医学院， 河北 唐山063000； 3.河北大学中医学院， 河北 保定071051； 4.河北省中医药科学院， 河北省浊毒证重点实验室， 河北 石家庄050031）

抑郁症是一种常见的慢性精神障碍性疾病，严重影响人的思维，情绪和身体健康［1］。据世界卫生组织（WTO）预测到2030 年全球将有3.5 亿人罹患抑郁症，且抑郁症在各个年龄段均可患病，其特点是情绪低落，缺乏活力，睡眠障碍，并在一定程度上伴有生活或工作能力的下降［2］。然而，到目前为止抑郁症的临床用药并没有得到令人满意的效果［3］。

荷梗属于睡莲科莲亚科植物睡莲的叶柄及花柄，又称藕杆、莲蓬杆、荷叶梗，味苦，性平，入脾、膀胱经，功效通气宽胸、和胃安胎，主治外感暑湿、胸闷不畅、妊娠呕吐、胎动不安［4］。本课题前期临床和实验研究表明，含有荷梗的中药复方具有很好的抗抑郁作用［5］；本研究采用慢性不可预见性温和刺激复制抑郁症小鼠模型，探索荷梗的抗抑郁效应及其可能的作用机制。

1 材料

1.1 动物 清洁级健康雄性ICR 小鼠40 只，购自河北医科大学动物实验中心，生产许可证号SCXK（冀）2018⁃004，鼠龄7 周左右，体质量（30±5）g。

1.2 试剂与药物 荷梗（批号180901）由河北中医药科学院附属医院提供，经河北省师范大学赵建成教授鉴定为正品，称定100 g 于10 倍量蒸馏水中浸泡1 h，温火煎煮2次，每次25～30 min，2 次滤液混匀后浓缩至生药量2、1 g／mL，再次过滤、分装，4 ℃保存备用；氟西 汀片（20 mg，法国生产，礼来苏州制药有限公司分装，批号J20170022）。Anti⁃TPH2 antibody（英国Abcam 公司，批号ab6336）；Anti⁃β CaMKII antibody（英国Abcam 公司，批号ab1806）；PV⁃9001 兔二步法检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号K182430C）；PV⁃9003 山羊二步法检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号K1824231）。

1.3 仪器 CX41 生物显微镜（日本Olympus 公司）；RM2245 旋转式切片机（德国Leica 公司）。

2 方法

2.1 小鼠抑郁模型制备 参照前期实验方法［6］稍作改良。除正常组外共用14 种应激刺激方法，分别为昼夜颠倒24 h、束缚2 h、禁食24 h、噪音2 h、禁水24 h、倾斜24 h、空笼24 h、冰水游泳5 min、异味24 h（每周不同）、摇晃5 min、潮湿24 h、热水游泳5 min、夹尾1 min、异物24 h（每周不同）。每天随机选取2 种进行，刺激方式不可预见，持续21 d。

2.2 分组、给药 适应性饲养1 周后，小鼠根据糖水偏爱分数随机分为正常组、模型组、氟西汀组及荷梗低、高剂量组，每组8 只。造模结束后，正常组和模型组给予生理盐水灌胃，阳性对照组给予氟西汀（10 mg／kg）灌胃，荷梗高、低剂量浓度比为2 ∶1，分别为0.4、0.2 g／kg，每天1 次，给药21 d。

2.3 糖水偏爱实验 参照前期文献报道，稍作改良［7］。小鼠在适应性饲养期间进行糖水训练，第1 天每笼均放2 瓶1%蔗糖水，第2 天一瓶为1%蔗糖水，一瓶为纯水，之后禁食禁水24 h，第4 天给予一瓶1% 蔗糖水、一瓶纯水，24 h后测糖水消耗，计算糖水偏好，公式为糖水偏好＝（糖水消耗／总液体消耗）×100%，正式实验于给药21 d 后检测。

2.4 强迫游泳实验 强迫游泳试验是参照Lin 等［8］的实验方法设计。在正式测试前1 d，小鼠放入高50 cm、长20 cm 的玻璃器皿（水温25 ℃左右）中适应性游泳训练15 min，正式实验时记录6 min 内出现静止不动的潜伏期和静止不动时间（后4 min），静止的标准是小鼠仅有头部露出水面，或只做为保持平衡四肢微微波动的动作。

2.5 旷场实验 参照前人研究［9］，旷场实验需在安静、光线暗的环境中进行。在正式试验前，所有小鼠均需在旷场（60 cm×60 cm，正方形底面等分成5 cm×5 cm 方格）内适应1 h，正式实验时从旷场中央区域放入，由动物行为分析系统记录5 min 内小鼠在中央区累计行走距离、在中央区停留时间和反复进入中央区的次数。

2.6 免疫组织化学检测 行为学测试结束后，所有小鼠用10%水合氯醛（5 mg／kg）腹腔麻醉，生理盐水透心灌流至肝脏发白后用4%多聚甲醛灌注，取全脑组织用于免疫组化，石蜡切片透明、脱蜡至水，经微波加热抗原修复，山羊血清室温封闭30 min，分别对应脑部位滴加Anti⁃TPH2抗体（1 ∶300）和Anti⁃β CaMKII 抗体（1 ∶200），置于4 ℃冰箱中12 h，PBS 洗3 次，5 min／次，分别对应滴加山羊抗兔IgG 和兔抗山羊IgG（二抗稀释倍数均为1 ∶200），室温下孵育30 min，PBS 溶液冲洗3 次，5 min／次，DAB显色反应3～5 min，水洗10 min 终止反应，苏木精复染，梯度酒精脱水，封片，CX41 显微照相系统观察，每只小鼠取5 张脑片，计数各组中缝背核TPH2 和外侧缰核CaMKII β 的免疫阳性细胞数。

2.7 统计学分析 应用SPSS 23.0 软件进行处理，实验数据以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析；两两比较如果方差齐则采用SNK⁃q 检验，如果方差不齐则采用Kruskal⁃Wallis 非参数检验。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 糖水偏爱 与正常组相比，模型组糖水偏爱分数减少（P＜0.01）；与模型组相比，氟西汀组及荷梗高剂量组糖水偏爱分数增加（P＜0.01），而且荷梗剂高剂量组与氟西汀组相比无差异（P＞0.05）。见表1。

表1 各组小鼠糖水偏爱分数的比较（， n＝8）

表1 各组小鼠糖水偏爱分数的比较（， n＝8）

注：与正常组比较，∗∗P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01。

3.2 强迫游泳 与正常组相比，模型组小鼠强迫游泳不动时间延长，潜伏期缩短（P＜0.01）；与模型组相比，荷梗各剂量组、氟西汀组小鼠迫游泳不动时间缩短，潜伏期延长（P＜0.05，P＜0.01）。见表2。

表2 各组小鼠强迫游泳不动时间和潜伏期的比较（，n＝8）

表2 各组小鼠强迫游泳不动时间和潜伏期的比较（，n＝8）

注：与正常组比较，∗∗P ＜0.01；与模型组比较，＃ P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.3 旷场实验 与正常组相比，模型组小鼠在中央区行走距离、中央区停留时间减短，反复进入中央区次数减少（P＜0.01）；与模型组相比，荷梗各剂量组、氟西汀组小鼠在中央区行走距离、在中央区停留时间增长，反复进入中央区的次数增加（P＜0.05，P＜0.01）。见表3。

表3 各组小鼠中央区行走距离、中央区停留时间、反复进入中央区次数的比较（， n＝8）

表3 各组小鼠中央区行走距离、中央区停留时间、反复进入中央区次数的比较（， n＝8）

注：与正常组比较，∗∗P ＜0.01；与模型组比较，＃ P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.4 相应脑区TPH2、β CaMKII 表达 与正常组相比，模型组小鼠中缝背核TPH2 的阳性细胞数量减少，外侧缰核β CaMKII 的阳性细胞数量增多（P＜0.01）；与模型组相比，荷梗各剂量组和氟西汀组小鼠中缝背核TPH2 阳性细胞数量增多（P＜0.01），外侧缰核βCaMKII 的阳性细胞数量减少（P＜0.05）。见表4、图1。

4 讨论

一般认为，应激是诱发抑郁症的一个重要因素，慢性不可预见性温和刺激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）［10］建立小鼠的抑郁模型是一种常见的动物模型，该模型动物的行为表现与人类抑郁症的表现高度相似。本研究观察到，模型组小鼠的糖水偏爱分数显著降低，证实造模成功，且模型组小鼠的强迫游泳不动时间明显增加，强迫游泳潜伏期显著缩短，用临床上公认的西药氟西汀作为阳性对照药，来验证中药荷梗的抗抑郁作用。旷场实验可检测小鼠在新异环境中的探究行为、紧张恐惧状态和对新环境的警觉性。本研究中，运动能力和探索行为能力的下降是抑郁症小鼠出现的典型表现。本研究结果显示，与模型组相比，中药荷梗组尤其高剂量组小鼠在中央区累计行走距离及在中央区停留时间显著增长，反复进入中央区的次数显著增多，且与氟西汀组相当，说明荷梗可以改善动物抑郁样行为和认知。

表4 各组小鼠TPH2、β CaMKII 阳性细胞数的比较（， n＝8）

表4 各组小鼠TPH2、β CaMKII 阳性细胞数的比较（， n＝8）

注：与正常组相比，∗∗P ＜0.01；与模型组相比，＃ P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

图1 各组小鼠TPH2、β CaMKII 表达（免疫组化染色，×200）

研究表明，5⁃羟色胺（5⁃HT）系统异常与抑郁症、焦虑症、厌食症、失眠、昼夜节律紊乱、内分泌功能障碍等密切相关［11］。色氨酸羟化酶（TPH）是5⁃HT 合成途径中的限速酶，色氨酸羟化酶2（TPH2）是色氨酸羟化酶（TPH）的一个亚型，是5⁃TH 神经元的特异性标志物之一［12］。据报道，TPH2 在中缝背核（DRN）中特异性表达，其含量减少会直接影响5⁃TH 的代谢功能，导致情感障碍和自杀行为［13］。缰核是边缘前脑和边缘中脑联系的重要节点，可分为内侧缰核（Medial habenula，MHb）和外侧缰核（Lateral habenula，LHb）。钙／钙调蛋白依赖性蛋白激酶II亚单位β（β CaMKII）是一种钙依赖性蛋白激酶，在部位表达上具有缰核特异性。LHb 和DRN 在调节抑郁中发挥重要作用。这两个区域在结构和功能上有着密切的联系。LHb 在应激条件下过度活跃，向下游的投射信号增强，可直接投射到DRN，抑制5⁃HT 的释放，从而导致抑郁的发生［14］。而LHb 在应激条件下被过度活化，可能是由于突触前膜谷氨酸释放增加，上调β CaMKII，提高兴奋性突触在AMPA 型受体的传播，而且LHb 可以直接控制DRN，并直接影响多巴胺能和5⁃HT 能的大脑系统，这些系统涉及多种大脑功能和神经精神疾病，比如抑郁症。目前认为缰核是调节厌恶行为和逃避行为的关键脑区，中缝背核是调节奖赏行为的关键脑区。外侧缰核和中缝背核之间有往返纤维，这表明对于某种刺激，小鼠选择厌恶性逃避还是进一步探索，可能是上述脑区协同调节的结果。如果外侧缰核神经元有更多活化，对中缝背核的抑制可能增加，表现为探索行为减少。反之，奖赏环路活化，探索行为增加。实验结果表明，与正常组相比，模型组小鼠脑内β CaMKII 的表达明显增多，TPH2 的表达显著减少，此结果与之前报道吻合［15］。与模型组相比，中药荷梗各剂量组小鼠脑内β CaMKII的表达明显减少，TPH2 的表达显著增多，且荷梗高剂量组的表达水平与西药氟西汀组相当。由此推断荷梗的抗抑郁作用机制可能与调节外侧缰核中β CaMKII 及中缝核中TPH2 水平的表达有关。

综上所述，荷梗对CUMS 小鼠具有抗抑郁作用，而通过抑制β CaMKII 的过度活化，从而减少对TPH2 的抑制可能是其作用机制之一。