不同储藏年限地黄化学成分分析

宋琳琳 薛淑娟 王利丽 张 飞 陈随清

（河南中医药大学药学院， 河南 郑州450046）

地黄为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosaLi⁃bosch的新鲜或干燥块根，列为上品，秋季采挖，除去芦头、须根及泥沙，鲜用，或将地黄缓缓烘焙至干，前者习称 “鲜地黄”，后者习称 “生地黄”［1］，始载于 《神农本草经》。清代陈嘉谟在《本草蒙荃》［2］中解释道：“江浙壤地种者，受南方阳气，质虽光润而力微，怀庆山产者，禀北方纯阴，皮有疙瘩而力大”，怀庆为河南焦作一带，至今仍以河南“怀地黄” 为道地药材，为“四大怀药” 之一，故本研究药材皆收集于河南。

地黄的化学成分大多为苷类，其中又以环烯醚萜苷类为主，从鲜地黄及干地黄中已分离鉴定出20 多种，如梓醇、二氢梓醇、乙酰梓醇、益母草苷、桃叶珊瑚苷、单蜜力特苷、蜜力特苷、益母草苷A、B、C、D 等；从地黄愈伤组织甲醇提取物中分离鉴定了4 种酚性苷类和8 种糖，如水苏糖、棉籽糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露三糖、毛蕊花糖及半乳糖［3］；李更生等［4］报道，地黄从鲜品加工成生地黄及熟地黄过程中，颜色从淡黄色变成黑色，梓醇含有量约降低至原来的1／7，而地黄苷A、地黄苷D 含有量变化不显著。

地黄经长时间放置后，断面亦会越来越黑；新鲜烘焙出的地黄断面的颜色通常为棕黄色、棕褐色、外黄内棕等，少见黑色，若呈黑色则大多为烘焦所致，且传统用药习惯认为生品烘焙好存放以3～5 年为佳，但其中成分不稳定，如按现有指标则不足以全面评价药材质量。因此，本研究在2015 年版《中国药典》 检查项目的基础上，增加氨基酸、糖类、环烯醚萜苷类等评价指标，全面了解不同储藏时间下地黄化学成分的变化规律，以期为其贮藏、加工提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器 岛津LC⁃20A 高效液相色谱仪（配置RI 检测器）、岛津UV⁃2600 紫外分光光度计（日本岛津公司）；Waters2695 高效液相色谱仪（配置2998 紫外检测器，美国Waters 公司）；电热恒温鼓风干燥箱（黄石市恒丰医疗器械有限公司）；KQ⁃500DV 数控超声清洗器（昆山市超声器有限公司）；恒温水浴锅（上海比朗仪器有限公司）；分析天平（十万分之一）、ALC⁃210.4 电子天平（万分之一）（德国赛多利斯公司）。

1.2 试剂与样品 梓醇（17030904）、毛蕊花糖苷（13042401）、地黄苷D（16091306）、地黄苷A（16072802 ）、果 糖（140811 ）、半乳糖（16070K01）对照品均购于四川省维克奇生物科技有限公司；益母草苷（L10A6Y2298）、棉籽糖（BBT0177）、水苏糖（K03D6S6823）、阿拉伯糖（Z29O7H23894）、甘露糖（A16O6L4546）、甘露三糖（15122402）、蜜二糖（K23M7S15176）对照品均购于上海源叶生物科技有限公司。石油醚（天津市富宇精细化工有限公司）；乙酸乙酯（天津市致远化学试剂有限公司）；磷酸、浓硫酸（北京化工厂）；双蒸水（实验室自制）。甲醇、乙腈（美国Fisher 公司）。样品具体信息见表1。

2 方法

2.1 氨基酸含有量测定 将25 份样品送于河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究中心，采用氨基酸分析仪，根据国家标准GB5009.124—2016（具体方法见附录Ⅰ）测定了16 种游离氨基酸的含有量及其总和。

2.2 梓醇、毛蕊花糖苷的含有量测定 按2015 年版《中国药典》 方法测定，色谱图见图1～2。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

图1 梓醇HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of catalpol

2.3 寡糖棉籽糖、蔗糖、水苏糖、果糖含有量测定

2.3.1 原理 由于糖类成分在正常的紫外区域和可见光范围内没有吸收，也无荧光，故不经过衍生的糖不适合使用紫外检测器和荧光检测器，应选择示差折光检测器。另外，糖类物质极性较大，因此选择NH2色谱柱进行分离。

图2 毛蕊花糖苷HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of verbascoside

2.3.2 色谱条件 Inertsil NH2色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈⁃水（70 ∶30）；体积流量1 mL／min，色谱图见图3。

图3 单糖、寡糖HPLC 色谱图（Ⅰ）Fig.3 HPLC chromatograms of monosaccharides and oligosaccharides（Ⅰ）

2.3.3 对照品溶液制备 精密称取对照品棉子糖5.06 mg、蔗糖3.41 mg、水苏糖9.83 mg、果糖4.97 mg，置于1 mL 量瓶中，加水溶解至刻度，即得（四者质量浓度分别为5.06、3.41、9.83、4.97 mg／mL）。

2.3.4 供试品溶液制备 精密称定60 ℃下烘72 h后粉碎成粗粉（过2 号筛）的地黄1.50 g，置于锥形瓶中，50 mL 蒸馏水回流2 h，取出放至冷却，蒸馏水补足减失质量，滤过，取续滤液20 mL，用等量石油醚和乙酸乙酯分别萃取2 次，取下层溶液，过0.22 μm 微孔滤膜备用。

2.4 葡萄糖、半乳糖、甘露三糖、蜜二糖、阿拉伯糖、甘露糖含有量测定

2.4.1 原理 为了尽可能多的检测糖的种类，对其进行柱前衍生化法处理。糖类物质极性较大，缺乏光学吸收基团，而衍生化可以使糖链结构带上紫外或者荧光基团。PMP 衍生试剂和糖链末端的反应在弱碱性介质中进行，具有条件温和、衍生产物稳定、无立体异构体，紫外吸收强的特点，适用于多种糖链分析。

2.4.2 色谱条件 Waters XBridge® shield C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；葡萄糖和半乳糖流动相乙腈（A）⁃20 mmol／L 乙酸铵（B）；甘露三糖、蜜二糖、阿拉伯糖、甘露糖流动相乙腈（A）⁃0.1% 甲酸（B），梯度洗脱，程序见表2；体积流量1 mL／min；检测波长245 nm，色谱图见图4～5。

表2 梯度洗脱程序Tab.2 Gradient elution programs

图4 葡萄糖、半乳糖HPLC 色谱图（Ⅱ）Fig.4 HPLC chromatograms of glucose and galactose（Ⅱ）

2.4.3 对照品溶液制备 精密称取对照品葡萄糖4.86 mg、半乳糖4.98 mg、甘露三糖4.79 mg、甘露糖 4.79 mg、蜜二糖 5.41 mg、阿拉伯 糖8.29 mg，置于1 mL 量瓶中，加水溶解至刻度，即得（五者质量浓度分别为4.86、4.98、4.79、4.79、5.41、8.29 mg／mL）。

2.4.4 供试品溶液PMP 衍生 取“2.3.4” 项下供试品溶液100 μL，依次加100 μL 0.3 mol／L NaOH 溶液、0.5 mol／L 1⁃苯基⁃3⁃甲基⁃5⁃吡唑啉酮（PMP）甲醇溶液至离心管中，混匀后于70 ℃下反应30 min，冷却后加入等量0.3 mol／L HCl 溶液反应，400 μL 氯仿离心萃取10 min，取上层溶液进行HPLC 分析。

图5 单糖、寡糖HPLC 色谱图（Ⅱ）Fig.5 HPLC chromatograms of monosaccharides and oligosaccharides（Ⅱ）

2.5 多糖含有量测定

2.5.1 原理 苯酚⁃硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，它在490 nm 波长处有最大吸收，再以比色法测定含糖量。

2.5.2 对照品溶液制备 取无水葡萄糖对照品10.47 mg，置于100 mL 量瓶中，蒸馏水溶解稀释至刻度，即得（质量浓度为0.104 7 mg／mL）。

2.5.3 最大吸收波长测定 吸取“2.5.2” 项下无水葡萄糖对照品溶液2 mL，依次加入1 mL 5%苯酚溶液、5 mL 浓硫酸，摇匀后放置5 min，水浴15 min后冰浴至室温，进行200～800 nm 全波长扫描。结果显示，其在490 nm 波长处有最大吸收，因此确定检测波长为490 nm。

2.5.4 生地黄多糖提取 取样品粉末100 g 于圆底烧瓶中，500 mL 石油醚回流提取1 h，重复操作1 次，滤过，滤渣挥干后加500 mL 80%乙醇回流提取1 h，重复操作1 次，滤过，滤渣挥干后加1 000 mL蒸馏水回流提取1 h，重复操作1 次，趁热滤过后合并滤液，减压浓缩至150 mL，加入硅藻土过滤，滤液加乙醇使其含醇量超过80%，置冰箱中静置12 h，弃上清液，沉淀用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤离心3 次，50 ℃烘干，即得。

2.5.5 换算因子测定 取5.1 mg 地黄多糖，置于50 mL 量瓶中，蒸馏水溶解定容，摇匀后取2 mL，测定吸光度，依据标准曲线算出多糖浓度，换算因子f计算公式为f＝W／（C×D），其中W为多糖质量（mg），C为多糖稀释液中葡萄糖质量浓度（mg／mL），D为多糖稀释因素。

2.5.6 供试品溶液制备与测定 取0.1 g 样品粉末，置于100 mL 锥形瓶中，加50 mL 95%乙醇振荡3 h，取出过滤，滤渣加50 mL 80% 乙醇振荡2 h，滤渣挥干，加50 mL 蒸馏水，60 ℃浸泡3 h，滤过，取2.3 mL 滤液，蒸馏水定容至10 mL 量瓶中，即得。取2 mL 供试品溶液于试管中，依次加入5%苯酚溶液1 mL、浓硫酸5 mL，摇匀后静置5 min，水浴15 min，取出冰浴至室温，测其吸光度。

2.6 地黄苷A、地黄苷D、益母草苷含有量测定

2.6.1 原理 环烯醚萜苷类化合物易溶于极性较大的溶剂中，一般采用溶剂提取法，利用超声波产生的强烈震动、较高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用，可以加速溶剂渗入药材中，促使环烯醚萜溶解。

2.6.2 色谱条件 Aichrombond⁃AQ C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈⁃水（3 ∶97）；体积流量1 mL／min；柱温30 ℃；检测波长203 nm；进样量20 μL，色谱图见图6。

图6 环烯醚萜苷类HPLC 色谱图Fig.6 HPLC chromatograms of cyclic allene terpenoids

2.6.3 对照品溶液制备 分别称取地黄苷A、益母草苷、地黄苷D 对照品0.42、0.10、0.58 mg，加双蒸水溶解摇匀，即得（三者质量浓度分别为0.42、0.10、0.058 mg／mL）。

2.6.4 供试品溶液制备 称取样品粉末2.0 g，置于锥形瓶中，加入60% 甲醇100 mL，称定质量，超声提取40 min，取出冷却至室温，60%甲醇补足减失的质量，滤过，弃去初滤液，量取20 mL 续滤液减压浓缩至近干，流动相溶解定容至5 mL 量瓶中，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得，冷藏备用。

2.7 方法学考察 梓醇、毛蕊花糖苷、地黄苷A、地黄苷D、益母草苷、果糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、甘露三糖、蜜二糖、蔗糖、棉子糖、水苏糖、总多糖在各自范围内线性关系良好（r＞0.998 0），精密度、稳定性、重复性、加样回收率试验结果均良好。

3 结果与分析

3.1 地黄中氨基酸含有量变化 随着储藏时间延长，总氨基酸含有量及天冬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、精氨酸含有量逐年下降，其中赖氨酸、精氨酸属于碱性氨基酸，见表3、图7。

3.2 地黄中化学成分含有量变化 随着储存时间延长，棉籽糖、水苏糖、总多糖含有量逐年降低，蔗糖、甘露三糖含有量先增后减，蔗糖在储存1 年后含有量最高，甘露三糖在储存2 年后含有量较高，蜜二糖含有量基本平稳；单糖中半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖含有量也有所增加，果糖、葡萄糖含有量先增后减；环烯醚萜苷类成分（梓醇、地黄苷D、地黄苷A、益母草苷）含有量下降；毛蕊花糖苷含有量有小幅度下降，但相对稳定。见表4、图8～10。

4 讨论

传统经验认为，地黄以块大、体质量、断面乌黑者为佳，地黄刚烘焙好时通常呈现棕黄、棕褐色等，随着储藏年限增加断面颜色会逐渐变黑，是逐渐发生美拉德反应的过程。地黄中含有丰富的美拉德反应底物，影响因素不仅包括糖类和氨基酸，还有温度、时间、pH、水分活度等［5］，储存时间的延长会促进美拉德反应，所以储藏时间长的生品断面颜色逐渐加深，直至变成乌黑色，美拉德反应的程度也逐渐加深。作为参加美拉德反应的反应物，碱性氨基酸含有量降低，与吴正善［6］、倪慕云［7］、龚跃新等［8］研究结果一致，同时棉籽糖、水苏糖、总多糖持续水解［9］；水苏糖水解为甘露三糖或棉籽糖［10］，棉籽糖水解为蜜二糖或蔗糖、半乳糖［11］，总多糖水解为阿拉伯糖和甘露糖，所以水苏糖含有量下降，阿拉伯糖、甘露糖含有量升高；甘露三糖、蜜二糖、蔗糖、乳糖等寡糖水解为葡萄糖、半乳糖、果糖等单糖［12］，所以还原糖含有量的变化趋势较为特殊，一方面从反应体系颜色的变化和氨基酸组分含有量的降低，可以判断美拉德反应的进行，部分还原糖参加反应被消耗；另一方面体系中又生成了大量的还原糖，2 个反应平衡的最终结果是体系中的的还原糖含有量有升有降。甘露三糖的含有量先增加后减少，上升阶段可能是由于水苏糖的水解产生了甘露三糖，下降阶段可能是由于其生成的速率要低于其自身的水解速率；蔗糖含有量上升阶段可能也是由于其大部分来源于棉子糖的水解，下降阶段是因为自身水解成了单糖，水解速率要高于生成速率；蜜二糖的含有量基本稳定，上升幅度较小，可能是其生成速率与水解速率基本一致。在美拉德反应的初级阶段，体系中游离氨基与游离羰基发生缩合生成不稳定的亚胺衍生物⁃薛夫碱，随即环化为N⁃葡萄糖基胺，后者在酸的催化下经过Amadori 分子重排，生成果糖基胺（1⁃氨基⁃1⁃脱氧⁃2⁃酮糖）［13⁃14］，此时葡萄糖与果糖都参与了美拉德反应，所以含有量下降。据报道，美拉德反应可导致体系中积累一定量的甲酸和乙酸，使体系酸化［15］呈弱酸性，果糖基胺进行1，2⁃烯醇化反应，再经过脱水、脱氨最后生成羟甲基糠醛，单糖中果糖、葡萄糖的含有量先增后减，其中果糖的变化趋势大于葡萄糖，可见其反应性大于后者［16］。

表3 不同储藏年限样品中氨基酸含有量测定结果（g／kg，， n＝5）Tab.3 Results of amino acid content determination in samples with different storage years（g／kg， x ±s， n＝5）

表3 不同储藏年限样品中氨基酸含有量测定结果（g／kg，， n＝5）Tab.3 Results of amino acid content determination in samples with different storage years（g／kg， x ±s， n＝5）

表4 不同储藏年限样品中各成分含有量测定结果（%，， n＝5）Tab.4 Results of content determination of various constituents in samples with different storage years（%， x ±s， n＝5）

图8 不同储藏年限样品中寡糖及总多糖含有量变化Fig.8 Variations of oligosaccharide and total polysaccharides contents in samples with different storage years

图9 不同储藏年限样品中单糖含有量变化Fig.9 Variations of monosaccharide contents in samples with different storage years

图10 不同储藏年限样品中环烯醚萜苷类及毛蕊花糖苷含有量变化Fig.10 Variations of cyclic allene terpenoid and verbascoside contents in samples with different storage years

环烯醚萜苷是地黄中的主要化学成分，其极性相对较大，易溶于水，但热稳定较差［17］。王宏洁等［18］发现，梓醇在酸碱条件下极不稳定；有文献表明，结合糖越多的环烯醚萜苷类成分越稳定，梓醇为单糖苷，容易发生反应［19］，所以在体系酸化后其含有量下降幅度很大，而地黄苷A、D，益母草苷属于双糖苷，下降幅度略小。另外，毛蕊花糖苷含有量下降可能是由于反应时体系酸化，发生可逆的酯化反应［20］，如毛蕊花糖苷可转化为异毛蕊花糖苷［21⁃22］。

综上所述，储藏时间越久，地黄断面颜色不断加深；寡糖含有量虽然会呈现先增后减的趋势，但总体还是下降的；总多糖、环烯醚萜苷类含有量逐渐降低；大多数化学成分经过3 年储藏后，其含有量都趋于平稳。薛淑娟等［23］研究不同商品规格中地黄化学成分的变化规律，发现随着断面颜色逐渐加深，环烯醚萜类、寡糖类成分含有量逐渐降低，而单糖类含有量逐渐升高，与本研究结果基本一致。因此，可将断面颜色作为依据来对不同品质的地黄进行区分，可为工业生产及医院用药提供参考依据。