锌指基因1对脑胶质瘤细胞增殖及凋亡能力的影响

郑励力，孙青芳

脑胶质瘤为临床常见神经系统肿瘤，恶性程度高，侵袭和迁移能力强。因此，治疗后复发率较高，预后不良[1,2]。锌指基因1（juxtaposed with another zinc finger gene 1，JAZF1）在甲状腺乳头状癌、子宫内膜间质肿瘤等肿瘤中呈现异常高表达[3,4]，且与肿瘤的恶性、严重程度相关联。本文主要研究脑胶质瘤中JAZF1 基因的表达特点及其对细胞生物学行为的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

人脑胶质瘤细胞株购于上海锐赛生物技术有限公司；绿色荧光蛋白标记的腺病毒载体Adv-GFP和Adv-JAZF1-GFP 由元和上海公司构建；RPMI 1640 培养基、胎牛血清、非必需氨基酸、丙酮酸钠、谷氨酰胺购于Gibco 公司；全蛋白提取试剂盒购于索莱宝科技有限公司；PVDF膜购于Millipore公司；ECL 化学发光检测试剂盒购于爱必信（上海）生物科技有限公司；MTT试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染 脑胶质瘤细胞采用含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、1%丙酮酸钠的RPMI 1640培养基，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培养。取传至第5 代且处于对数生长期的细胞，分为3 组：对照组、空载组和过表达组；分别于无血清的RPMI 1640 培养基中，加入Adv-JAZF1-GFP或空载体Adv-GFP，对照组不予转染腺病毒，24 h常规培养后收集各组细胞进行后续检测。每组实验均重复3次。

1.2.2 MTT 比色法检测细胞增殖 收集转染后的细胞以5×103/mL的浓度接种于96孔板，200 μL/孔，37 ℃、5%CO2过夜培养，于1、3、5、7 d 进行MTT 检测（参照说明书），采用酶标仪检测OD490值，绘制细胞生长曲线。

1.2.3 细胞凋亡检测 收集转染后的细胞，0.25%胰蛋白酶消化，离心并收集细胞，PI染色后，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.4 Western blot 法检测Wnt 信号通路各蛋白表达量 细胞以1×105/孔接种于6孔板，转染细胞，融合达到50%～60%时提取总蛋白质，常规进行Western blot 检测，孵育的一抗为糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase，GSK-3β）、β-连环蛋白（β-catenin）、腺瘤性结肠息肉病相关基因（adenomatous polyposis coli，APC）、Bax、Bcl-2，ECL显影。

1.3 统计学处理

采用SPSS 21.0软件处理数据。符合正态分布以及方差齐性的计量资料以（±s）表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK-q检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞活力比较

对照组、空载组和过表达组的细胞活力分别为（88.42±6.72）%、（89.49±4.27）%和（51.48±9.26）%；对照组和空载组细胞的活力差异无统计学意义（P＞0.05），过表达组细胞的活力低于其他2组（P＜0.05）。

2.2 各组凋亡情况比较

对照组、空载组和过表达组的凋亡率分别为（8.63±2.01）%、（10.21±3.17）%和（26.37±5.15）%；对照组和空载组细胞的凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05），过表达组的细胞的凋亡率高于其他2组（P＜0.05）。

2.3 Wnt信号通路相关蛋白表达量比较

对照组和空载组β-actenin、GSK-3β、APC、Bax和Bcl-2蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05），过表达组β-actenin、GSK-3β、APC 和Bax 蛋白表达低于其他2 组，Bcl-2 蛋白表达高于其他2组（P＜0.05），见表1。

表1 Wnt信号通路相关蛋白表达量比较（±s）

表1 Wnt信号通路相关蛋白表达量比较（±s）

注：与过表达组比较，①P＜0.05

3 讨论

脑胶质瘤是由外胚叶组织衍化而来的神经间质细胞的肿瘤[5]。其发病机制复杂，相关致病突变基因较多，临床常规治疗以手术联合化疗以及放射治疗为主[6]，但疗效果并不理想。有研究显示，脑胶质瘤手术后加上精确的放疗，1 年的存活率为79%，2年的存活率为55%，3年的存活率为46%[7]。

JAZF1 是核蛋白编码基因，由3 个C2H2 样锌指结构构成，有助于染色质稳定性维持[1]。JAZF1是一个与2型糖尿病、子宫内膜间质肉瘤、甲状腺乳头状癌和前列腺癌相关联的基因[8,9]。JAZF1水平在不同级别的脑胶质瘤患者中表达有差异，且级别越高差异越明显。推测JAZF1 对脑胶质瘤的发生和发展具有一定的调控作用，且与脑胶质瘤的严重程度有关系。本研究结果显示，上调JAZF1后，体外培养的人脑胶质瘤活力降低、凋亡增加。

Wnt信号通路对细胞的增殖、凋亡可进行调控[10-12]。Wnt信号通路的成分都非常保守，其由Wnt 分泌蛋白、β-catenin、T 细胞因子/淋巴增强因子（TCF/LEF）、APC、GSK3β、轴蛋白等组成[13,14]。β-catenin以3种方式存在于正常成熟细胞中，但少量游离β-catenin 存在于细胞内，大部分则与E-cadherin结合，剩余的则形成复合体通过氨基端磷酸化被U3 泛素连接酶β-转导素重复蛋白（β-TRCP）识别并被泛素化，最后被26S蛋白酶体降解。

JAZF1可能在脑胶质瘤的进程中发挥抑制作用。本研究结果显示：上调JAZF1可抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。细胞的增殖、凋亡是重要的生物学现象且受到多种基因的严格控制[15]。Bcl-2 蛋白家族通过控制线粒体通透性调节细胞凋亡，Bcl-2 有三大亚家族：抗凋亡蛋白、促凋亡蛋白和孔隙形成促凋亡蛋白，例如Bax 蛋白[16]。本研究中，Western blot 结果证实了上调JZAF1，促进了β-actenin、GSK-3β、APC 和Bax 的表达，抑制了Bcl-2蛋白表达水平。当Wnt通路被激活时，一系列的分子事件会使β-catenin 蛋白增多，β-catenin 进入细胞核与其他因子相结合形成核内复合物[17,18]。

综上所述，上调JAZF1 可能通过作用于Wnt/β-catenin 信号通路，调控β-catenin、GSK-3β、Bax、APC、Bcl-2蛋白的表达，抑制脑胶质瘤细胞的增殖，促进脑胶质瘤细胞的凋亡。