武夷名丛茶树种质资源茶多糖抗氧化活性分析

石玉涛，郑淑琳，吴伟伟，罗盛财，陈夏婷，王飞权，李远华，张 渤

（1.武夷学院茶与食品学院，茶叶福建省高校工程研究中心，福建 武夷山 354300；2.武夷山市龟岩茶业有限公司，福建 武夷山 354300）

0 引言

【研究意义】武夷岩茶是闽北乌龙茶的优秀代表，以其独特的“岩骨花香”品质特征和良好的降血脂、抗过敏、抗氧化作用而受到消费者喜爱[1]。武夷山茶区独特的生态环境孕育出丰富多彩的武夷名丛茶树种质资源，为武夷岩茶新品种选育和产品开发提供了宝贵材料。随着茶产业向集约化方向发展，肉桂、水仙等品种成为武夷岩茶生产中的主栽品种，武夷名丛的种植面积越来越小，许多名丛因管理不善而逐步衰老枯死，有的甚至被挖毁改种，造成武夷名丛茶树种质资源的多样性日益耗失。近年来，在当地政府和茶人的努力下，数百份武夷名丛逐步被收集并建圃保存，但对于武夷名丛的科学鉴定评价和发掘利用工作还较为滞后[2]。因此，系统开展武夷名丛种质资源的鉴定评价，对武夷名丛茶树种质资源的保护和开发利用具有重要意义。【前人研究进展】茶多糖（Tea polysaccharides, TPS）是茶叶中的一种重要的生理活性物质，具有显著的降血糖、抗氧化、增强机体免疫调节能力等保健功效，有望开发成为防治糖尿病和心血管疾病的新型功能性食品和药物[3]。目前，关于茶多糖的研究集中在提取分离、纯化[4]、结构表征鉴定及生物活性方面[5]，对原料性能与生物活性关系研究的报道较少。已有研究表明，茶多糖特性和生物活性存在品种多样性[6]。而对于不同品种的罗望子[7]、枣[8]等植物多糖的研究也揭示了植物多糖的抗氧化活性具有品种间差异。近年来，学者对武夷名丛茶树种质资源的农艺性状[9]、叶片解剖结构[10]和生化成分[11]等进行了较为深入的研究。【本研究切入点】目前对武夷名丛茶树种质资源茶多糖特性和抗氧化活性的研究鲜见报道。笔者前期对金毛猴等5 份武夷名丛茶多糖清除羟基自由基活性进行了初步研究[12]，发现不同武夷名丛茶多糖清除羟基自由基活性存在差异，但该研究覆盖武夷名丛材料份数少，对武夷名丛茶多糖特性和抗氧化活性的分析和评价尚不够全面。【拟解决的关键问题】本研究以31 份武夷名丛茶树种质资源为试材，以相同条件和方法提取茶多糖，测定茶多糖基本组分和清除DPPH 自由基（DPPH·）、羟基自由基（·OH）的活性，并采用聚类热图分析和隶属函数法对武夷名丛茶树种质资源进行分类和综合评价，旨在探明不同武夷名丛茶树种质资源茶多糖的组成特征和体外抗氧化活性差异，筛选出含有高抗氧化活性茶多糖的武夷名丛种质，为武夷名丛茶树种质资源的开发利用和乌龙茶新品种的选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试的31 份武夷名丛茶树种质资源采集自武夷山龟岩种植园茶树资源圃（闽茶圃004 号），每份种质种植小区长×宽为 15 m×1.8 m，茶树树龄为3～18年，基本信息见表1。该圃位于福建省武夷山市星村镇前兰村梅子桥（东经117°97′59″，北纬27°61′50″），海拔200 ～270 m，土层深厚，灌溉条件便利，属中亚热带季风湿润气候区；光照充足，雨量丰沛，温湿度适宜，适合茶树生长[13]。圃内种质资源材料均由其来源地取无病虫害的枝梢在圃内进行扦插繁育保存，立地土壤条件和肥水管理一致。

1.2 主要仪器与试剂

FZ102 型微型植物粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；Alpha2-4 型冷冻干燥机，德国Christ 公司；GK 系列型电子分析天平，赛多利斯科学仪器北京有限公司；JJ-I 型精密增力定时电动搅拌器，江苏金坛市中大仪器厂；UV-3200PC 型分光光度计，上海嘉鹏科技有限公司；Neofuge 15R 型高速冷冻离心机，香港力康生物医疗科技有限公司。半乳糖醛酸、脱氧核糖（DR）、硫代巴比妥酸（TBA）、1,1-二苯基苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH），美国Sigma-Aldrich 公司；上述及其他试剂（购自中国医药集团化学试剂有限公司）均为分析纯。

表1 供试材料基本信息Table 1 Basic information on tested materials

1.3 试验方法

1.3.1 样品采集与处理 武夷名丛茶树种质资源鲜叶原料采自春季第1 轮新梢，每份种质资源材料从种植小区中随机选择60 株以上茶树，从树冠外围中部随机采摘一芽二叶新梢600～800 g，重复3 次。新梢采摘后蒸汽杀青固样，烘干、粉碎后过40 目筛，置于-20℃冰箱中保存备用。

1.3.2 茶多糖的提取 参照倪德江等[14]的方法，采用水提醇沉淀法提取茶多糖。按式（1）计算粗茶多糖提取率：

1.3.3 茶多糖组分测定 糖醛酸含量测定采用硫酸-咔唑法[15]；蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝G-250 法[16]；中性糖含量测定采用蒽酮-硫酸法[17]；茶多酚含量测定采用福林酚法[18]。

1.3.4 茶多糖清除自由基活性测定

茶多糖清除羟基自由基活性测定 将提取的茶多糖配制成5.0 mg·mL-1，采用D-脱氧核糖-铁体系法测定不同武夷名丛茶多糖对·OH 自由基的清除率[19]。

茶多糖清除DPPH·自由基活性测定 将提取的茶多糖配制成1.0 mg·mL-1，参照CHEN 等[20]的方法测定不同武夷名丛茶多糖对DPPH·自由基的清除率。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2019 软件进行数据整理；采用TBtools（Toolbox for Biologists）v0.6696 生物信息学分析软件进行层次聚类（HCA）并绘制聚类热图[21]，聚类方法为Complete-linkage 法，距离为欧氏距离；以每个性状极差的1/10 为间距将各性状分为10 个等级，采用Shannon-Wiener 指数法计算各性状的遗传多样性指数（H′），计算公式为：多样性指数（H′）=-ΣPilnPi，其中Pi 为某性状第i 个代码出现的频率[22]；采用模糊数学隶属函数法对武夷名丛茶多糖抗氧化活性进行综合评价，隶属值=（X-Xmin）/（Xmax-Xmin），式中X 为测定值，Xmax为最大值，Xmin为最小值，反隶属函数与抗氧化活性呈负相关，反隶属函数值=1-（X-Xmin）/（Xmax-Xmin）[23]。

2 结果与分析

2.1 武夷名丛茶树种质资源茶多糖组成分析

2.1.1 茶多糖提取率分析 31 份武夷名丛茶树种质资源茶多糖的提取率见图1。不同种质武夷名丛茶多糖提取率差异较大，茶多糖提取率最高的种质为MC28（九龙珠），提取率达3.39%，提取率最低的种质为MC14（香石角），提取率为1.73%，相差1.66%；茶多糖提取率的变异系数为18.33%，遗传多样性指数为2.05，说明武夷名丛茶多糖的提取率存在种质间差异性。

2.1.2 茶多糖基本组分分析 31 份武夷名丛茶树种质资源茶多糖中各组分含量如图2 所示。茶多糖中中性糖含量在25.75%～67.21%，含量最高的种质是MC31（正白毫），最低的种质是MC15（红鸡冠）（图2-A）；糖醛酸含量在11.10%～22.57%，含量最高的种质是MC26（岭下兰），最低的种质为MC10（向天梅）（图2-B）；蛋白质含量变幅为2.24%～7.42%，含量最高的种质为MC04（玉笪），最低的种质是MC31（正白毫）（图2-C）；茶多酚含量在3.81%～9.68%，含量最高的种质是MC11（金丁香），最低的种质是MC31（正白毫）（图2-D）；4 个指标的变异系数在16.74%～22.68%，平均变异系数19.55%，遗传多样性指数在1.93～2.18，平均值为2.05。

2.2 武夷名丛茶树种质资源茶多糖体外抗氧化活性分析

2.2.1 茶多糖清除自由基活性分析 31 份武夷名丛茶树种质资源茶多糖清除DPPH·和·OH 自由基活性如图3 所示。茶多糖对DPPH·自由基的清除率在25.47%～84.30%，清除率最高的种质为MC07（玉蟾），清除率最低的种质是MC31（正白毫）（图3-A）；茶多糖对·OH 自由基清除率在34.98%～78.38%，清除率最高的种质为MC04（玉笪），最低的种质是MC13（金鸡母）（图3-B）。茶多糖对DPPH·和·OH自由基清除率的变异系数分别为23.71%和20.68%，平均变异系数为22.20%，遗传多样性指数分别为2.05 和2.09，平均遗传多样性指数2.07。

2.2.2 基于茶多糖组成和清除自由基活性的聚类热图分析 基于茶多糖组成和清除自由基活性对31 份武夷名丛进行聚类热图分析，结果见图4。31 份武夷名丛茶树种质资源可分为3 类，第一类（Ⅰ）包含MC29、MC31 2 份资源，此类资源茶多糖清除·OH自由基能力较强，清除DPPH·自由基能力弱，提取率和中性糖含量高，其余组分含量低；第二类（Ⅱ）包含MC10、MC16、MC17、MC06、MC13、MC11、MC14、MC18、MC05、MC12、MC27、MC20、MC23、MC02、MC25 15 份资源，此类资源茶多糖清除DPPH·自由基能力较强，清除·OH 自由基能力弱，提取率低，各组分含量均较高；第三类（Ⅲ）包含MC19、 MC21、 MC28、 MC03、 MC04、 MC09、MC22、 MC30、 MC01、 MC07、 MC08、 MC15、MC24、MC26 14 份资源，此类资源的主要特征是茶多糖DPPH·和·OH 自由基能力强，提取率较高，中性糖含量低，其余组分含量高。对茶多糖组成和抗氧化活性7 个指标的聚类结果显示，提取率和中性糖2 个指标与其余5 个指标明显分开，表明茶多糖组分中蛋白质、茶多酚和糖醛酸含量与DPPH·和·OH 自由基清除率相关性较强，这3 种组分对茶多糖清除DPPH·和·OH 自由基活性的贡献较大，其中蛋白质和茶多酚与清除DPPH·自由基活性关系相对较近，糖醛酸与清除·OH 自由基活性关系相对较近，而提取率和中性糖含量与DPPH·和·OH 自由基清除率相关性较弱。

图1 武夷名丛茶多糖提取率Fig.1 TPS extraction rates of various Wuyi Mingcong tea germplasms

图2 武夷名丛茶多糖基本组分含量Fig.2 Composition of TPS extracted from various Wuyi Mingcong tea germplasms

图3 武夷名丛茶多糖对DPPH 自由基和·OH 的清除能力Fig.3 Scavenging rates on DPPH· and ·OH by TPS extracted from various Wuyi Mingcong tea germplasms

图4 31 份武夷名丛种质资源基于茶多糖基本组成和抗氧化活性的聚类热图Fig.4 Clustered heatmap of 31 Wuyi Mingcong tea germplasms based on composition and antioxidant activity of TPS

2.2.3 茶多糖体外抗氧化活性综合评价 利用隶属函数法对武夷名丛茶多糖体外抗氧化活性进行多指标综合评价，结果见表2。31 份武夷名丛种质资源平均隶属函数值在0.16～0.79，平均隶属函数值排名前5 位的武夷名丛种质为MC08（九龙兰）、MC07（玉蟾）、MC04（玉笪）、MC01（白鸡冠）、MC15（红鸡冠），说明这5 份武夷名丛茶多糖抗氧化活性较强；排名后5 位的武夷名丛种质为MC31（正白毫）、MC29（正太阳）、MC13（金鸡母）、MC10（向天梅）、MC17（红孩儿），说明这5 份材料茶多糖的抗氧化活性较弱。排名前5 位的5 份材料位于聚类分析的第三类，排名后2 位的2 份材料与聚类分析第一类的2 份材料一致，由此表明采用隶属函数法对武夷名丛种质资源茶多糖抗氧化活性的综合评价可获得与聚类分析基本一致的类群划分结果。

表2 31 份武夷名丛茶树种质资源茶多糖抗氧化活性的隶属函数分析Table 2 Subordinate function analysis on antioxidant activity of TPS extracted from 31 Wuyi Mingcong tea germplasms

3 讨论与结论

种质资源是作物遗传育种的物质基础，种质资源遗传差异大小直接影响性状遗传改良和研究利用的效果[24]。本研究结果显示同一生境下保存的31 份武夷名丛茶树种质资源茶多糖的提取率、茶多糖基本组分和清除自由基活性具有明显的种质间差异，说明不同武夷名丛茶树种质资源之间茶多糖组成特征及抗氧化活性的差异主要受基因型的影响，这与陈玉琼等[6]的研究结果一致。不同武夷名丛茶多糖组成特征和清除自由基活性具有丰富的遗传变异性，茶多糖组成和清除自由基活性7 个指标平均变异系数为20.13%，平均遗传多样性指数达2.05，表明武夷名丛茶树种质资源茶多糖性状变异丰富、类型广泛，可为选育出满足不同保健价值的育种目标提供丰富的种质材料。

前人研究表明，茶多糖抗氧化活性与茶叶种类、茶多糖一级结构及其中的中性糖、蛋白质和糖醛酸含量等有关[25,26]。本研究结果显示，茶多糖对DPPH·和·OH 自由基的清除率均与其组分中糖醛酸、蛋白质和茶多酚含量呈正相关，说明糖醛酸、蛋白质和茶多酚对武夷名丛茶多糖抗氧化活性的贡献较大；艾于杰[27]研究表明，粗多糖与纯化后的各多糖组分均可清除DPPH·自由基，但纯化后的多糖组分清除DPPH·自由基的能力有明显下降，推测粗多糖清除DPPH·自由基活性为各组分与茶多糖结合后协同作用的结果，这与本研究结果一致。但聚类热图分析结果表明武夷名丛茶多糖组分中中性糖含量与其抗氧化活性呈负相关，推测武夷名丛茶多糖的结构特征可能对其抗氧化活性有更明显的影响[28]。

·OH 自由基是机体内氧化活性最强的一种瞬态自由基，可诱导机体发生氧化损伤。在D-脱氧核糖-铁体系中，Fe2+-EDTA 在磷酸盐缓冲液中与H2O2反应引发产生·OH，·OH 与DR 反应产生MDA，再与TBA 在酸性加热的条件下形成色素[29]。本研究中，加入不同种质武夷名丛茶多糖样品后，MDA 生成量明显减少，说明茶多糖可通过与DR 竞争·OH 方式达到清除自由基的效果。DPPH·自由基是一种以氮为中心的稳定的自由基，其水溶液具有紫红色特征吸收峰，抗氧化剂可以与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，溶液颜色逐渐变浅，褪色程度与其所接受的电子数成定量关系[30]。本研究中，加入不同种质武夷名丛茶多糖样品后，溶液颜色变浅，吸光度变小，说明武夷名丛茶多糖可通过替代或结合方式使体系中DPPH·自由基数量减少，达到清除自由基的效果。本研究结果显示，DPPH·自由基清除率高的武夷名丛茶多糖，其·OH 自由基清除率并不一定高，这一方面说明武夷名丛茶多糖对瞬态自由基和稳定自由基的清除能力不同，另一方面也说明茶多糖可通过多种机制和途径实现清除自由基的效果[31]，其机理有待进一步研究。

聚类分析是应用多元统计分析原理研究问题分类的一种数学方法，可同时对大量性状进行综合考察[32]，热图是近年来被广泛应用的一种统计方法，可以简单地聚合大量数据，将结果以一种渐近的色带直观地区性展现出来，两种多元统计方法已广泛应用于多样品、多指标的植物种质资源分类研究工作中[33]。本研究采用层次聚类热图分析将31 份武夷名丛茶树种质资源分为3 类，各类群间茶多糖组成和抗氧化活性指标存在明显差异。故在武夷名丛茶树种质资源茶多糖性状筛选时，可以结合不同类群的特点加以利用，从而提高亲本选择的效率和可预知性。

综上所述，31 份武夷名丛茶树种质资源茶多糖组成和体外抗氧化活性存在明显差异和多样性，茶多糖抗氧化活性较强的5 份武夷名丛种质为九龙兰、玉蟾、玉笪、白鸡冠、红鸡冠，可作为武夷岩茶保品质育种的亲本材料。进一步开展武夷名丛茶多糖构效关系研究，其将为武夷名丛茶树种质资源的开发利用和乌龙茶保健育种提供更为全面的理论参考。