油梨根际AM 真菌多样性与土壤养分相关性分析

黄 婷，王明元，秦紫艺，刘昕炜，徐志周，孙 越，刘紫萱，董 涛

（1.华侨大学园艺科学与工程研究中心，福建 厦门 361021；2.广东省农业科学院果树研究所/农业农村部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室/广东省热带亚热带果树研究重点实验室，广东 广州 510640）

0 引言

【研究意义】油梨（Perseaamericana Mill）又名牛油果、幸福果、樟梨等，原产于拉丁美洲，我国台湾、海南、广东、福建、广西、云南的大部分地区均可种植。油梨果实富含脂肪酸，被誉为“森林黄油”[1]，在医疗保健方面，具有清除有害胆固醇、软化血管、抗老化、降血脂等多种功效[2]。在食品加工方面，油梨油具有不易被氧化，可高温加热而不冒烟的特点。我国自20 世纪初开始引进油梨，直到近几年才引起广泛关注。尽管国内油梨消费剧增，却仍然主要依赖进口，2010—2016 年间我国油梨进口量从1.9 t 增长至2.5 万t，进口幅度成指数增长[3]，这主要是因为我国油梨种植面积及产量品质不能满足国内市场的需求[4]。

丛枝菌根（Arbuscular mycorrhizal, AM）真菌是一类在土壤中广泛存在的微生物，能够与大多数植物根系形成共生结构，促进宿主植物生长，提高植物的产量[5]、抗逆性[6]，增强植物利用水分与矿质营养的能力[7]。当前我国发现并保藏的AM 真菌共有190 多种[8]。AM 真菌的分布受土壤因子、地理因子、气候因子、宿主植物与人为干扰因素的影响，其中的非生物因子，尤其是土壤因子的影响最为显著[9]。【前人研究进展】已有许多研究表明了火龙果[10]、猕猴桃[11]等多种植物的根际AM 真菌多样性与土壤因子密切相关，如火龙果根系AM 真菌孢子密度与土壤有机质、水解氮、全氮呈显著正相关，而多样性指数与土壤有机质呈显著负相关；而猕猴桃根系AM 真菌孢子密度与土壤速效磷呈显著正相关、与全氮呈极显著负相关、与pH 呈显著负相关。当前关于油梨的研究主要集中在栽培、选种、贮藏与营养价值及医疗保健等方面，关于油梨的生态学适应性方面的研究很少[12]。Tamayo 等[13]发现单独或共同接种解磷菌（Mortierella sp.）与AM 真菌（Rhizoglomusfasciculatum）都可以促进油梨对磷元素的吸收以及地上部生长，且共同接种比单一接种促进效果更佳。目前尚未见有关于油梨根际AM 真菌多样性以及其与土壤养分因子相关的文献报道。【本研究切入点】本研究采集我国主产区油梨根际土壤，分析油梨根际AM 真菌多样性，以及与土壤相关理化性质之间的关系。【拟解决的关键问题】进一步阐明油梨植物、AM 真菌和土壤养分三者之间的关系，筛选AM真菌优势种，充分利用AM 真菌资源进行油梨果园的水肥管理、引种栽培，从而促进油梨的产业化发展。

1 材料与方法

1.1 样品采集

采样时间于2018 年春季，土壤样品采集地点位于我国油梨主产区（表1）：广东省（广东省农业科学院果树研究所）、广西壮族自治区（广西崇左市扶绥县山圩镇山圩农场）和云南省（保山市隆阳区潞江镇芒棒村，德宏州瑞丽市勐秀乡户瓦村，德宏州瑞丽市勐秀乡勐秀村，德宏州瑞丽市云南省农业科学院热经所瑞丽实验站）等地采集12 个土壤样品。样品采集：在每一个采样地采用随机取样法，选取5 株油梨树，在滴水线范围，剥离土壤表层枯叶、杂草、碎石，利用取土器收集0～20 cm 土样，其中每株树沿滴水线均匀采集5 份土壤，共计1 kg，混合均匀，带回实验室。将所有土壤样品均匀铺在报纸上，去除大颗粒碎石、杂质，置于室温下通风干燥2 周，待测。

表1 油梨根际土壤样品来源Table 1 Source of avocado rhizosphere soil samples

1.2 AM 真菌孢子分离与鉴定

采用湿筛倾析-蔗糖离心法分离油梨根际土壤中AM 真菌孢子[14]，在体式显微镜下计数。用移液枪吸取单个孢子于载玻片上，采用水、PVLG、乳酸等做浮载剂，显微镜下观察孢子颜色，连孢菌丝特征，并测量孢子大小。微用力压破孢子观察孢壁层次，厚度，颜色以及内含物，辅助鉴定使用Melzer’s 试剂，观察是否变色及变色情况，拍照记录。

参照Schenck 等[15]的《VA 菌根真菌鉴定手册》，刘润进等[16]的《菌根学》以及国际AM 真菌孢子鉴定网站INVAM（http://invam.caf.wvu.edu,edu/Myc-Info/）的分类描述及近年来发表的新种进行（属）种的检索及鉴定。

1.3 AM 真菌多样性指标

孢子密度（spore density, SD）=每100 g 风干原始土样中总AM 真菌孢子数。

种的丰度（species richness, S）=油梨根际每100 g土壤中AM 真菌种的数目。

分离频度（frequency, F）=（AM 真菌某种或属的样方数/总样方数）×100%。

相对多度（relative abundance, RA）=（AM 真菌某种或属的孢子数/AM 真菌总孢子数）×100%。

重要值（importance, I）=采用样点或环境中AM真菌的属（种）的分离频度、相对多度的平均值（重要值），即I=（F+RA）/2。优势属、种划分：根据结果将AM 真菌划分为4 个优势度等级，I≥50%为优势属、种；I≥30%～50%为常见属、种；I≥10%～30%为较常见属、种；I＜10%为稀有属、种。

Shannon-Weiner 物种多样性指数（H）：假设1个包含N 个体的随机样本，其种i 的个体数为Ni，则Pi=Ni/N。因此H 可以表示为：

式中：k 为样点中AM 真菌的种数；Pi为样点AM真菌种的孢子密度占该样点总孢子密度的百分比；

物种均匀度（J）= H/lnS；S 为样点AM 真菌的种类数目。

1.4 油梨根际AM 真菌群落相似性系数测定

按Sorenson 系数公式计算不同样地油梨根际AM 真菌群落组成相似性系数：Cs = 2j/（a +b）；j 为2 个样地共同存在的油梨根际AM 真菌的种数目；a 为某样地油梨根际的AM 真菌种数目，b 为另一样地油梨根际的AM 真菌种数目。将AM 真菌群落物种相似度划分为：极高（0.80～1.00）、高（0.61～0.80）、中（0.41～0.60）、低（0.21～0.40）、极低（＜0.20）。

1.5 油梨根系土壤理化性质分析

参照鲍士旦的《土壤农化分析》[17]，采用电位法测定土壤pH 值，重铬酸钾容量法-稀释热法测定有机质，NH4F-HCl 浸提-钼锑抗比色法测定有效磷，碱性扩散法测定有效氮，参照杨俐萍等[18]方法，用原子吸收分光光度计测定有效钾。采样地根际土壤因子分析如表2。

1.6 数据统计

采用Excel 软件进行数据整理，SPSS25.0 数据统计软件对试验数据进行单因素方差分析、多因素方差分析、相关性分析。

表2 油梨根际土壤因子分析Table 2 Analysis on factors of avocado rhizosphere soil

2 结果与分析

2.1 油梨根际土壤AM 真菌多样性

2.1.1 根际土壤AM 真菌种质资源与分布 本试验以广东、广西、云南主产区7 个样地土壤中共分离AM 真菌3 属33 种，其中球囊霉属（Glomus）种类最丰富，共22 种，占总种数的65%；无梗囊霉属（Acaulospora）7 种，占总种数的21%；盾巨孢囊霉属（Scutellospra）4 种，占总种数的14%（表3）。3 属在7 样地中均有分布，球囊霉属种数在各样地分布频度为50%～69%，无梗囊霉属为15%～25%，盾巨孢囊霉属为12%～25%，说明油梨根际AM 真菌种质资源丰富，其中，球囊霉属分布频度远高于其他属，为优势属。

由表3、4 可知，木薯球囊霉、瑞氏无梗囊霉、深红盾巨孢囊霉、黑色盾巨孢囊霉在所有样地中均有分布，且I＞50%，为各地共有优势种（图1）。近明球囊霉、疣突球囊霉在SY1 以外的样地均有分布；疣状无梗囊霉在SY2 以外样地均有分布；纯黄球囊霉、网状球囊霉、副冠球囊霉、细凹无梗囊霉在RL 以外样地广泛存在；疣壁盾巨孢囊霉在GD 以外样地均有分布。幼套球囊霉、金黄球囊霉、两型球囊霉、布氏球囊霉在MX、GD 以外样地均有分布，异型球囊霉在SY1、GD 以外样地均有分布，沙荒球囊霉、异配盾巨孢囊霉在SY1、RL 以外样地均有分布。重要值I 介于30%～50%为常见种，包括：白色球囊霉、纯黄球囊霉、幼套球囊霉、近明球囊霉、沙荒球囊霉、金黄球囊霉、两型球囊霉、网状球囊霉、异性球囊霉、布氏球囊霉、副冠球囊霉、疣突球囊霉、疣状无梗囊霉、细凹无梗囊霉、疣壁盾巨孢囊霉及异配盾巨孢囊霉。悬钩子球囊霉为HW 的特有种。从油梨根际AM 真菌分离出较多的共有优势种与常见种，说明这些AM 真菌可以适应油梨的种植环境，推测其可以与油梨建立良好的共生关系，而常见种没有出现在所有样地中，可能是因为这些种对某些土壤因子或气候因子敏感。

2.1.2 油梨根际AM 真菌多样性 不同样区油梨AM 真菌种类与多样性指数均存在较大差异（表5），其中MB 样区种丰度最高，共分离出31 种孢子，占总种数的94%，孢子密度最高，共1 749 cfu·100 g-1，同时Shannon-Wiener 指数最高，达3.22；RL 样区的孢子密度、种丰度及Shannon-Wiener 指数最低，说明RL 地区AM 真菌物种多样性低；HW 与GD 种丰度很高，共分离出29 种与25 种孢子，但是孢子密度低，说明AM 真菌分布地区种丰度与孢子密度没有直接相关性。

表3 油梨根际AM 真菌种质资源与分布情况Table 3 Germplasms and distribution of AM fungi in avocado rhizosphere soil

表4 油梨根际AM 真菌相对丰度、分离频度、重要值Table 4 Relative richness, isolation frequency, and importance of AM fungi in avocado rhizosphere soil

2.1.3 油梨根际AM 真菌相似性分析 由表6 可知，不同采样地油梨根际AM 真菌组成的相似性系数为0.29～0.92，其中MB 与HW、SY2、GD，以及HW与SY2、GD 之间相似性系数极高且较为接近，为0.85～0.92。SY1 与SY2、MB、HW，SY2 与MX、RL、GD，MB 与MX，MX 与HW、RL、GD 之间相似性系数水平高，为0.62～0.78。7 个采样地之间相似性系数普遍高或者极高，其中MB 与其他样地相似性普遍较高，说明MB 样地油梨根际的AM 真菌种类具有代表性。SY1 样地与GD、MX 相似性系数水平低，分别为0.29 与0.36，而这3 地油梨同为“哈斯”品种，且不同品种的油梨反而出现相似性水平高的现象，说明品种可能不是影响油梨根际AM 真菌的主要因素，更可能与其他因子相关。

2.2 油梨根际AM 真菌多样性与土壤养分相关性

对油梨根际AM 真菌多样性与土壤养分因子进行相关性分析（表7）。结果表明种丰度及多样性指数与速效磷成极显著负相关（P＜0.01），说明油梨AM 真菌多样性受土壤速效磷含量的影响大，而与其他因素无显著影响。

3 讨论与结论

3.1 油梨根际AM 真菌多样性

本研究发现油梨根际AM 真菌丰富，7 个样地中共分离出AM 真菌3 属33 种，其中球囊霉菌是优势属，其次是无梗囊霉属。这与张美庆等[19]发现球囊霉属为广谱生态型，其次为无梗囊霉属的结论相一致。球囊霉属真菌与植物根系共生形成泡囊储存脂类物质，扩大了菌丝的侵染途径，从而能够广泛适应于各种生境[20]。向丹等[9]认为AM 真菌分布受土壤因子、地理因子、气候因子及宿主植物及人为干扰的影响，其中土壤因子是最主要的影响因素。样地间AM 真菌多样性存在差异，但差异不大。郭绍霞等[21]发现，不同品种牡丹影响AM 真菌多样性及群落组成。而在本研究中，种植不同油梨品种“哈斯”、“福瑞特”、“缅甸品种1”、“缅甸品种2”的土壤AM 真菌之间相似性大多高或极高，这是因为油梨虽然是高度杂交作物，但其遗传变异率并不高[12]。因此不同品种油梨对AM 真菌的影响并不大。而种植同一“哈斯”品种的样区反而存在土壤AM 真菌相似性低的现象，这可能是因为油梨种植区允许其他矮小的草本植物覆盖土表，宿主多样性会影响AM 真菌的多样性。但更可能的因素是各地土壤养分差异大，造成真菌多样性的差异。决定AM 真菌多样性的并不是单一的因素，而是各生态因子作为整体综合发挥作用的结果[21]。MB 与其他样地相似性普遍高，说明MB 样地最能代表7 个样地油梨根际的AM真菌种类。

表5 不同试验区AM 真菌孢子密度、种丰度、多样性指数Table 5 Spore density, species richness, and diversity index of AM fungi at different sites

表7 油梨根际AM 真菌多样性与土壤因子相关性分析Table 7 Correlation between AM fungal diversity and rhizosphere fertility

接种AM 真菌Rhizoglomusfasciculatum 可有效提高油梨对P 的吸收以及地上部的生长[13]。说明AM真菌可与油梨形成共生结构，促进油梨生长发育。陈保东等[22]认为接种土著AM 真菌，由于长期适应环境，更容易与植株根系形成共生结构，而接种其他AM 真菌，可能要面临与当地真菌强烈竞争，导致接种失败。因此油梨专用菌肥可从油梨根际土壤分离的AM 真菌中筛选，更容易得到好的效果。此外，研究已发现蜜色无梗囊霉、聚丛球囊霉、幼套球囊霉及摩西球囊霉可以显著促进多种植物，如蓝莓、构树等吸收P 元素，促进植株生长，并提高根际酶活性，改善根际微环境[23、24]。推测这些AM 真菌对于广泛适应于多种植物根系，推测接种油梨根系时，对油梨生长也会有很好的促生效果。为筛选专用菌肥提供参照。

3.2 AM 真菌与土壤因子关系

本研究表明，AM 真菌种丰度及多样性指数与土壤P 含量呈显著负相关，这与刘海跃等的研究结果一致。土壤高浓度的有效磷抑制丛枝菌根的生长发育，缩短菌丝分枝和总长度，这是由于磷浓度高时寄主植物根系分泌物成分发生变化导致的[25]。土壤内的磷总量十分丰富，但大多被矿石等固定，不能为植物吸收。AM 真菌能够分解土壤中难溶磷，转化为宿主植物可吸收的养分，分泌并活化多种土壤酶类，降低pH，提高土壤养分含量，并通过菌根结构转移给植物根系，同时扩大宿主植物根系网络，让根系吸收更多的营养，同时疏松土壤，增加根系透气性。AM 真菌与植物共生机制是“双赢”的营养交换模式，AM 真菌为植物提供矿质营养与养分，而植物为AM 真菌提供C 源保证真菌生长与繁殖。当土壤N、P 缺乏时，植物受营养胁迫上调独脚金内酯的表达，刺激AM 真菌繁殖并侵染根系，以换取自身得到更多的土壤养分[26]。因此，适当的磷胁迫，可以刺激更多AM 真菌与植株根系建立共生结构。Elisa Bona 等研究发现，对油梨同时施用AM 真菌与解磷菌对油梨的生长量与吸收磷的效果比单独施用AM 真菌或解磷菌的效果好[27]。在磷含量高的土壤区域接种AM 真菌，即使土壤内天然AM 真菌含量高，也能够显著提高AM 真菌丰度并显著提高作物生长量，并在一定程度上可以代替磷肥[28]。

刘润进等[29]认为在一定范围内，有机质含量越高，AM 真菌孢子密度与多样性越高；而超过一定范围，反而受抑制。本研究中，MB 样地有机质含量最高，其孢子密度、种丰度与多样性指数也最高，其中孢子密度达1 749 cfu·g-1。而有机质含量最低的RL样地，各指数也最低，孢子密度仅109 cfu·g-1，但其余样地没有表现出这样的相关性，可能是受其他养分因素的综合影响大。如MX 样地，有机质与速效磷含量适中，但土壤AM 真菌孢子密度不高，可能的原因是，MX 样地碱解氮含量高，硝态氮积累多，导致土壤pH 偏低（4.04），抑制AM 生存，同时样地海拔较高，气候较冷，不适于AM 真菌生长发育。

研究表明，使用化肥N、P 元素，与土壤内AM真菌直接接触会降低AM 真菌多样性与活性，在油梨种植园区，应减少使用无机肥料，以有机肥或缓释肥代替无机肥，不造成土壤养分大起大落，为AM真菌定植与侵染油梨根系，提供相对稳定的环境。从长远上看，建立AM 真菌稳定的土壤生态环境，对于减少化肥与农药使用量有重要意义，可以降低生产成本，减轻农户负担，使农户更乐于使用。