芙蓉李咀嚼片酚类物组成及其生物活性

汤葆莎，赖谱富，李怡彬，吴 俐，翁敏劼，郑恒光

（1.福建省农业科学院农业工程技术研究所，福建 福州 350003；2.福建省农产品（食品）加工重点实验室，福建 福州 350003）

0 引言

【研究意义】芙蓉李是福建李果产业的主栽品种，也是主要的李果加工品种（占95%以上），在永泰、福安、屏南、永安等地均有大面积种植，单永泰一县的种植面积就达9133.33 hm2[1]。芙蓉李成熟期主要集中在6～7 月，采摘周期短，且易腐、不易较长时间保藏，主要被加工成李干、蜜饯类产品，造成芙蓉李加工产业存在产品单一、产品附加值低、经常供过于求等困境，影响产业可持续发展[1]。鉴于芙蓉李果实营养丰富，含有蛋白质、可溶性糖、有机酸（主要为苹果酸[2-3]）等，特别是含有花色苷等酚类活性物质[4-5]，利用芙蓉李果实中的多酚物质开发咀嚼片类功能食品潜力大，开展芙蓉李咀嚼片酚类物质及其生物活性研究可为产品开发提供依据，赋予产品营养健康新概念。【前人研究进展】前人对红枣藕节[6]、五味子[7]、蓝莓复方[8]、即食型复方黄精[9]和麦麸膳食纤维[10]咀嚼片的抗氧化能力进行研究，得出各种咀嚼片均有提高机体抗氧化能力的作用。芙蓉李属于高多酚含量的李果品种，果实中儿茶素的含量高达295.89 mg·kg-1[11]，而植物多酚是一类广泛存在于植物体内的抗氧化剂，有抗氧化、预防癌症和心血管疾病、抑菌消炎和抗病毒等作用，是一种具有独特生理活性和药理活性的次生代谢天然产物[12-14]。同时，也有学者对蔬菜醇提物[15]、谷物杂粮醇提物[16]和几种天然产物[17]等物质对黄嘌呤氧化酶XOD 的抑制性进行了研究。【本研究切入点】笔者前期研究已发现芙蓉李多酚提取物具有抗氧化和抑制黄嘌呤氧化酶XOD 活性的作用[18]。但目前尚未有针对芙蓉李加工产品酚类物质组分及含量和生物活性的研究报道。【拟解决的关键问题】本研究以选定的芙蓉李加工产品咀嚼片为样本，分析产品酚类物质组分及含量，探讨其体外抗氧化和辅助降尿酸的能力，以期为芙蓉李加工产业发展提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

芙蓉李果粉制备：芙蓉李果经清洗、去核、切片后，采用热泵干燥机60 ℃干燥、粉碎而成。

芙蓉李多酚粉制备：取芙蓉李果粉，利用超声波辅助乙醇提取（60%乙醇、超声时间30 min、提取温度50 ℃）后，减压浓缩（-0.098 MPa，50 ℃）去乙醇，并将芙蓉李多酚溶液浓缩至17%，4 ℃冰箱冷藏保存备用；利用喷雾干燥法制备芙蓉李多酚粉，选用麦芽糊精∶β-环糊精∶阿拉伯胶=7∶2∶1 作为壁材，喷雾干燥参数：芯材壁材比为1∶4，进风温度为130 ℃，进料固形物含量为15%，进料流量300 mL·h-1；制备的芙蓉李多酚粉呈紫红色。

麦麸菌粉制备[10]：以面粉厂直接购置的麦麸为发酵基质、食用菌秀珍菇（Pleurotus geesteranus）-XJ为发酵菌株，采用固液多级优化培养方式获得秀珍菇液体菌种，麦麸基质固体培养的最终含水量为120%（其中接种量为30%），于培养箱中27 ℃遮光培养至菌丝长满培养基质，之后50～60 ℃热风烘干至恒重，再粉碎至100～200 目而制得麦麸菌粉（其膳食纤维质量分数达40.14%）。

阿拉伯胶（食品级）：上海权旺生物科技有限公司；麦芽糊精（食品级）：DE=12，石家庄华辰淀粉糖生产有限公司；β-环糊精（食品级）：江苏丰园生物技术有限公司；微晶纤维素等其他辅料皆为食品级。

1.2 仪器与设备

SY6000 小型喷雾干燥仪（上海世远生物设备工程有限公司）、KQ-600DV 数控超声波清洗器（昆山市超生仪器有限公司）、765P 紫外分光光度计（上海光谱仪器有限公司）、CJY-300C 型智能片剂脆碎度测定仪（上海黄海药检仪器有限公司）、YPD-300D 型片剂硬度仪（上海黄海药检仪器有限公司）、ZB-1G 型智能崩解仪（天津海益达科技有限公司）、ZP9A 型旋转式压片机（上海天凡药机制造厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 芙蓉李咀嚼片制备工艺流程[10，19-20]芙蓉李咀嚼片制备工艺流程如下：原料→混合→搅拌均匀→压片→质量检验→包装→成品。

前期项目组对芙蓉李咀嚼片配方已做了大量的筛选试验，试验发现，芙蓉李果粉和芙蓉李多酚粉由于易受潮，直接压片制成咀嚼片太僵硬，不好咀嚼，且原料的流动性差。为改善原料的流动性，提高咀嚼片的质量，须在添加15%～20%麦麸菌粉、10%微晶纤维素、5%～10%麦芽糊精的条件下，才能使制作咀嚼片的粉末原料的流动性、可压性和润滑性达到片剂制备的要求。本试验只将与酚类物质相关的芙蓉李咀嚼片配方纳入研究中，制作芙蓉李咀嚼片的步骤为：首先按配方将所需的每种原料和辅料粉称量好；其次按1∶1 比例、以从少到多的顺序进行粉料的混合，分批次混合完毕后再混合均匀；然后将混合均匀的粉末放入高速旋转式压片机中压片，制成成品。

1.3.2 片质量、崩解时限、硬度及脆碎度测定[10，19-20]片质量测定：取样品20 片，分别精密称定，计算平均片质量和标准差。

崩解时限测定：取样品3 片，分别置于智能崩解仪的吊篮玻璃管中，每管各放一分散后记录每片崩解的时间，取平均值为其崩解时限。

硬度测定：取6 片芙蓉李咀嚼片，在片剂硬度仪上分别对片剂硬度进行测定，以其平均值为最终片剂硬度指标。

脆碎度测定：取10 片芙蓉李咀嚼片，用风机吹去其外表粉末，称取质量后，放置于脆碎度测定仪中转动100 次，取出后再用同法除去外表粉末，称取其质量，计算出脆碎度。

1.3.3 芙蓉李咀嚼片提取液制备 将芙蓉李咀嚼片捣碎，按料液比[咀嚼片物料质量（g）∶乙醇溶液体积（mL）]1∶30 的比例，在带塞的三角瓶中加入咀嚼片和60%乙醇（V / V），以提取时间60 min、功率420 W、温度50 ℃的参数为条件，于超声波清洗器中进行提取，之后将提取液抽滤、浓缩至无醇味后，制备得到咀嚼片提取液，密封，置于4 ℃冰箱备用。咀嚼片提取液用于测定多酚含量、清除DPPH自由基和羟自由基能力及XOD 抑制活性，以固形物含量标定其浓度。

1.3.4 总多酚及总黄酮含量测定[21-22]以没食子酸作为标准品，采用Foin-Ciocaheu 法测定总多酚含量。取200 μL 样品，加入2.5 mL 10%（V / V）福林酚溶液，摇匀后，在室温下遮光放置2 min，再加入2 mL质量浓度为75 g·L-1的Na2CO3溶液，混匀，用蒸馏水定容后，于50 ℃水浴锅中水浴15 min，快速冷却至室温，以相应试剂为空白，在分光光度计波长765 nm处检测吸光度值。总多酚质量浓度以每毫升样液中所含的没食子酸当量（mg·mL-1）表示。

采用硝酸铝比色法测定芙蓉李咀嚼片中总黄酮含量。

1.3.5 酚类物质测定[23]采用高效液相色谱法测定。色谱条件：C18色谱柱，4.6 mm×250 mm，粒径5 μm；流动相：A 为2%甲酸溶液，B 为乙腈，用前过0.45 μm 滤膜脱气；柱温：40 ℃；流速：0.8 mL·min-1；检测波长：280、320、360 nm；进样量：10 μL。

1.3.6 清除DPPH 自由基能力测定[18]将溶解于甲醇中 的5 mL 100 μmol·L-1DPPH 添 加 到1 mL 提 取 物中，再将其重新悬浮于蒸馏水中。混合均匀后，将混合物静置暗中25 ℃放置30 min。使用分光光度计在波长517 nm 处测定吸光度，以未添加DPPH 溶液的样品为空白对照。按以下公式计算清除DPPH 自由基的能力：

抗氧化能力（抑制率，%）= [（Ac－As）/Ac]×100，其中Ac是对照品（不含DPPH 溶液样品）的吸光度值；As是测试样品的吸光度值。

1.3.7 清除羟自由基能力的测定[18，24]取1.0 mL 的0.15 mol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.4）、2 mL 的 0.52 mg·mL-1番 红 溶 液、1.0 mL 的6 mmol·L-1EDTA-Na2-Fe2＋和0.5 mL 的样液，混合摇匀后加入0.8 mL 的0.3% H2O2，立即置于40 ℃水浴锅中水浴30 min，空白组用等体积的超纯水代替样品溶液，对照组为等体积超纯水代替样液和H2O2溶液；之后于分光光度计波长520 nm 处测定吸光度A。清除羟自由基的能力根据以下公式计算：

羟自由基清除能力/%=[（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100，其中As、Ab和Ac是测试样品、空白组和对照组的吸光度值。

1.3.8 XOD 抑制活性测定[22，25]取少量冻干后的多酚样品用二甲基亚砜（DMSO）溶解，再用0.2 mol·L-1磷酸缓冲盐溶液稀释至不同浓度，在酶标板中依次加入50 μL 样品与150 μL 0.4 mmol·L-1的黄嘌呤，35 ℃下保温5 min，再加入50 μL 0.05 U·mL-1的XOD，摇匀放置25 min 后，用80 μL 1 mol·L-1的HCL 终止反应；每个样品3 个平行，以磷酸缓冲盐溶液作为空白对照。取反应液以超纯水稀释10 倍，用0.25 μm水性膜过滤后，用高效液相色谱法检测尿酸生成量，以250 nm×4.6 mm×5 μm 的 C18柱为色谱柱，其余色谱液相条件为流动相：甲醇-0.015 mol·L-1磷酸二氢胺溶液（15∶85）、检测波长295 nm、运行时间10 min、流速0.8 mL·min-1、进样量20 μL。

2 结果与分析

2.1 不同生产配方对芙蓉李咀嚼片感官品质和物理特性的影响

在前期试验基础上，设置2 个与酚类物相关的咀嚼片配方，按1.3.1 的流程制作咀嚼片，考察2 种配方对芙蓉李咀嚼片感官品质和物理特性的影响。从表1 可以看出，原料中增加或减少芙蓉李果粉、减少或增加麦麸菌粉的比例，咀嚼片的片重、脆碎度和崩解时限无明显差异，感官风味变化不大，但芙蓉李果粉添加多、麦麸菌粉添加少就会使产品硬度增大，咀嚼后粘牙程度加剧，这可能是由于芙蓉李果粉含有蔗糖、果糖等糖类物质，而麦麸菌粉膳食纤维含量较高，可增大原料流动性的缘故。

表1 不同配方的各项检测指标Table 1 Testing criteria on ingredients for tablet formulation

色泽是感官评价食品品质的一个重要因素，尽管芙蓉李果粉的比例增加，咀嚼片红绿值a*升高（增加了3.92%）、亮度L*和黄蓝值b*降低，但差异不显著，2 种咀嚼片均呈紫红色。综合咀嚼片物理特性和感官质量，选择配方B 作为本研究检测样本的芙蓉李咀嚼片生产配方。

2.2 芙蓉李咀嚼片酚类物质分析

根据上述优化配方制备出的芙蓉李咀嚼片，其酚类物质如表2 所示。咀嚼片中酚类物质含量达到0.630 8%，主要以黄酮类物质为主，占酚类物质的83.04%；咀嚼片中花色苷含量有4.354 6 mg·hg-1，这可能是咀嚼片呈紫红色原因。咀嚼片中还含有表儿茶素、原花青素、儿茶素、原花青素B 等酚类单体，其中表儿茶素的含量最高（53.423 9 mg·hg-1）、原花青素次之（12.849 mg·hg-1）。

2.3 芙蓉李咀嚼片清除DPPH 自由基能力

DPPH 被广泛用于定量测定天然产物和生物活性成分的抗氧化能力，芙蓉李咀嚼片清除DPPH 自由基能力的试验结果见图1。咀嚼片与Vc 清除DPPH自由基能力都是随着浓度的升高，清除率增大，呈正相关的量效关系；而质量浓度在0.16 mg·mL-1时，芙蓉李咀嚼片与Vc 清除DPPH 自由基的能力无明显差异。芙蓉李咀嚼片DPPH 自由基清除率的IC50值为0.07 mg·mL-1，接近于Vc 的IC50值0.064 mg·mL-1，表明芙蓉李咀嚼片与Vc 有相同的DPPH 自由基清除能力。

表2 芙蓉李咀嚼片的酚类物质分析Table 2 Phenols in chewable plum tablets

2.4 芙蓉李咀嚼片清除羟基自由基能力

图1 芙蓉李咀嚼片的DPPH 自由基清除能力Fig.1 Scavenging ability on DPPH free radicals of chewable plum tablets

羟基自由基是最活泼的活性氧自由基之一，容易与生物分子反应，引起组织损伤或细胞死亡，从而导致机体的衰老和疾病。由图2 可知，芙蓉李咀嚼片提取液能有效清除羟基自由基，清除率随浓度增加而显著提高（P＜0.05），且呈现出一定的剂量效应；当两者质量浓度为0.9～1.5 mg·mL-1时，芙蓉李咀嚼片清除羟基自由基的能力和Vc 相比，有明显差异；通过清除率拟合曲线，芙蓉李咀嚼片清除羟基自由基的IC50值为0.79 mg·mL-1，略高于对照组Vc 的IC50值0.63 mg·mL-1。说明芙蓉李咀嚼片具有较强的羟自由基清除活性。这可能是由于芙蓉李咀嚼片含有原花青素（12.849 mg·hg-1）、表儿茶素（53.423 9 mg·hg-1）等酚类物质。

图2 芙蓉李咀嚼片的羟基自由基清除能力Fig.2 Scavenging ability on hydroxyl free radicals of chewable plum tablets

2.5 芙蓉李咀嚼片XOD 抑制活性

XOD 是机体嘌呤代谢主要的催化酶，可催化次黄嘌呤转化为黄嘌呤，进而催化发生氧化产生尿酸；体内尿酸浓度过高将导致高尿酸血症，进而诱发痛风等代谢性疾病，而黄嘌呤氧化酶抑制剂可降低体内XOD 的活性，从而减少尿酸生成。芙蓉李咀嚼片的XOD 抑制活性如图3 所示。随着浓度的增加，芙蓉李咀嚼片和别嘌呤醇对XOD 的抑制能力也增加。作为阳性对照，别嘌呤醇在低浓度下对XOD 显示出高抑制活性；芙蓉李咀嚼片在20～1 000 μg·mL-1对XOD 也有一定的抑制作用，400 μg·mL-1的浓度其抑制率达62.12%。检测得出芙蓉李咀嚼片和别嘌呤醇的IC50分别为258.96 μg·mL-1和7.19 μg·mL-1。

图3 芙蓉李咀嚼片的黄嘌呤氧化酶抑制能力Fig.3 Xanthine oxidase inhibition ability of chewable plum tablets

3 讨论与结论

本研究以芙蓉李及其多酚提取物为主要原料研制出芙蓉李咀嚼片，咀嚼片配方为芙蓉李果粉40%、芙蓉李多酚粉20%、麦麸菌粉20%、微晶纤维素10%、麦芽糊精10%，制成的咀嚼片颜色呈紫红色，完整光洁，无裂片分层，边沿光滑整齐，酸甜可口，硬度适宜，咀嚼性良好。

植物多酚是植物的次生代谢产物，有助于预防心脑血管和癌症等疾病的发生，其抗氧化活性与总酚的含量相关[26]。有文献报道花色苷具有强大的抗氧化和清除自由基的能力，对人体微循环有特殊改善的功效，以高效和高生物利用而著称[27]；喻秀娟等[28]也已报道李子皮原花青素具有较强清除羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH·自由基的能力。本研究显示芙蓉李咀嚼片中酚类物质含量达到0.630 8%，主要以黄酮类物质为主，含有表儿茶素、原花青素、花色苷等酚类单体，这些元素对抗氧化和清除自由基有一定的作用，芙蓉李咀嚼片清除DPPH 自由基和羟基自由基的IC50值分别为0.07 mg·mL-1和0.79 mg·mL-1，与Vc 相当，这与Ma 等[29]发现酚类物质含量直接影响提取物的DPPH 清除率的研究一致，表明其有较强的抗氧化能力。Li 等[18]的研究也表明，芙蓉李多酚类物质能够直接捕获活性氧，阻止过氧化过程。由此推测，芙蓉李咀嚼片较好的抗氧化性来源于其丰富的小分子酚类物质活性成分。

XOD 是引导尿酸生成的一种重要酶，黄嘌呤氧化酶抑制剂通过抑制XOD 的活性来减少黄嘌呤与次黄嘌呤向尿酸盐的转化，从本质上减少尿酸的生成，来达到治疗痛风的目的[28-31]。在临床上抑制XOD的药物有别嘌呤醇、非布司他等，这些西药虽然见效快，但副作用大。如别嘌呤醇用后，病人易引起发热、腹痛、腹泻、过敏性皮疹、白细胞及血小板减少，甚至有可能出现肝功能损害等副作用，因而这些降尿酸西药应用受到明显限制，从植物寻找副作用小的天然降尿酸药物或食物是目前研究的热点[18]；有研究表明茶多酚等天然产物可抑制XOD 介导的尿酸产生[30-31]。本研究发现，虽然芙蓉李咀嚼片XOD抑制活性低于常规降尿酸药物别嘌呤醇，但仍有较强的抑制活性（IC50为258.96 μg·mL-1）。因此，本试验表明芙蓉李咀嚼片具有较好的抗氧化性和黄嘌呤氧化酶抑制活性，为可我国芙蓉李精深加工产品的开发利用提供依据，开发为抗氧化功能食品和辅助降尿酸功能食品的潜力大。