miR-671-5p通过靶向肿瘤坏死因子α诱导蛋白8调控胰腺癌细胞增殖和凋亡

2020-10-31张晓红陈宏海

解剖学杂志 2020年5期

李锐王霞张晓红陈宏海马跃

（沈阳市第五人民医院，沈阳 110023）

胰腺癌是最具侵袭性的恶性肿瘤之一，其5年生存率极低[1]，80%以上的患者确诊时已发生侵袭转移，治愈率较低[2]。因此，早期诊断和治疗是提高和改善胰腺癌预后的关键。微小RNA（microRNAs，miRNA）是一类高度保守的非编码短链RNA，通过与靶向mRNA 的3'UTR 结合抑制翻译过程。超过一半的已知miRNA 通过直接靶向癌基因或抑癌基因参与了人类肿瘤的发生或转移[3]。研究显示miR-671-5p 在胃癌细胞中低表达，过表达miR-671-5p 抑制胃癌细胞增殖，诱导细胞凋亡[4]；在骨肉瘤中miR-671-5p 也呈低表达，上调其表达可阻滞细胞周期，抑制骨肉瘤细胞增殖[5]。但miR-671-5p 在胰腺癌组织中的表达及其对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响尚未有研究。肿瘤坏死因子α 诱导蛋白8（tumour necrosis factor-alpha-induced protein 8，TNFAIP8），是一种抗凋亡和致瘤分子，研究显示人胰腺癌组织中TNFAIP8 的表达明显高于正常胰腺组织，干扰TNFAIP8 表达可发挥抗增殖和侵袭作用[6-7]。生物信息学分析显示TNFAIP8是miR-671-5p 的潜在靶基因，但miR-671-5p 能否靶向TNFAIP8 参与胰腺癌进展尚未可知。本研究旨在揭示miR-671-5p 对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响和调控机制，以期为胰腺癌的早期诊疗提供新的靶点。

1 材料和方法

1.1 实验材料

收集2016年5月至2017年5月间沈阳市第五人民医院肝胆胰外科收治并经病理学确诊的20 例胰腺癌患者的胰腺癌组织及与其对应的癌旁正常组织（距离癌灶边界≥3 cm），离体30 min 内置于液氮罐冻存。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

人胰腺癌细胞capan-1 购于上海斯信生物科技有限公司；人正常胰腺导管上皮细胞HPDE6C7 购于上海雅吉生物；DMEM 培养基购于北京索莱宝生物科技公司；胰蛋白酶购于美国Gibco 公司；胎牛血清购于杭州四季青生物公司；LipofectamineTM2000 和TRIzol 试剂购于美国Invitrogen 公司；模拟物阴性对照（miR-NC）、miR-671-5p 模拟物（miR-671-5p mimics）、小干扰RNA 阴性对照（si-NC）、TNFAIP8 小干扰RNA（si-TNFAIP8）、野生型荧光素酶报告基因载体（WT-TNFAIP8）、突变型荧光素酶报告基因载体（MUT-TNFAIP8）以及PCR 引物均由上海吉玛制药公司提供；四甲基偶氮唑蓝（MTT）试剂盒、膜联蛋白V 异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）试剂盒购于上海碧云天生物公司；TNFAIP8 抗体购于上海瑞齐生物科技有限公司；B 细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）抗体购于美国Santa Cruz 公司；四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）试剂盒、兔源磷酸甘油醛脱氢酶（phosphoglyceraldehyde dehydrogenase，GAPDH）抗体、兔源细胞周期D1（cyclin D1）抗体、鼠源p21 抗体、兔源Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗体、HRP 标记的山羊抗小鼠及山羊抗兔IgG 购于北京百奥莱博生物科技有限公司。

1.2 细胞培养和分组

Capan-1细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中进行培养，培养条件为37℃、含5% CO2的细胞培养箱。用0.25%的胰蛋白酶消化后进行传代培养。将对数期capan-1细胞接种于6孔板，当细胞融合度约为60%时，按照LipofectamineTM2000说明书步骤分别将miR-NC、miR-671-5p mimics、si-NC、si-TNFAIP8转染至capan-1细胞，依次记为miR-NC组、miR-671-5p组、si-NC组、si-TNFAIP8组。为进一步验证miR-671-5p是通过调控TNFAIP8表达进而影响胰腺癌细胞增殖和凋亡，将pcDNA和pcDNA-TNFAIP8分别与miR-671-5p mimics共转染至capan-1细胞，并依次记为miR-671-5p+pcDNA组和miR-671-5p+pcDNA-TNFAIP8组。

1.3 qRT-PCR 检测miR-671-5p 和TNFAIP8 mRNA 的表达水平

用TRIzol 试剂从胰腺癌组织、癌旁组织和各组capan-1 细胞中提取总RNA。采用cDNA 合成试剂盒将RNA 逆转为cDNA。随后，使用SYBR Premix Ex Taq 在ABI 7500 上进行qRT-PCR。分别以U6 和GAPDH 为内源性对照，引物序列如下：miR-671-5p-正向引物序列为5'-ACACTCCAGCTG GGAGGAAGCCCTGGAGGGG-3'；TNFAIP8-反向引物序列为5'-TGAAGATGGAGCACTGCTG A-3'，TNFAIP8-反向引物序列为5'-GGTCTGTTA CCCGTTAGGAAG-3'；U6-正向引物序列为5'-C TCGCTTCGGCAGCACA-3'，U6-反向引物序列为5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'GAPDH-正向引物序列为5'-TGACTTCAACAGCGACACC CA-3'，GAPDH-反向引物序列为5'-CACCCTGTTG CTGTAGCCAAA-3'。2-ΔΔCt法计算miR-671-5p 和TNFAIP8 mRNA 的相对表达量。

1.4 双荧光素酶报告基因实验验证miR-671-5p 和TNFAIP8 的靶向关系

采用生物信息学数据库StarBase 预测miR-671-5p 靶基因显示，TNFAIP8 是miR-671-5p 的潜在靶基因，随后利用双荧光素酶报告基因实验验证两者靶向关系。将miR-NC、miR-671-5p mimics分别与WT-TNFAIP8 和MUT-TNFAIP8 共转染至capan-1 细胞，转染48 h 检测各组capan-1 细胞荧光素酶活性变化。为验证两者的调控关系，分别将miR-NC、miR-671-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-671-5p 转染至capan-1 细胞，转染48 h 时免疫印迹检测TNFAIP8 表达变化。

1.5 MTT 实验检测细胞活力

将对数期capan-1 细胞按照5×103个/孔接种到96 孔板，当细胞融合度约为60%时，按照上述分组进行细胞转染，分别在转染24、48、72 h 时间点，向每孔内加入20 μL 的MTT 试剂，培养箱内孵育4 h，弃去上清液，每孔加入150 μL 的二甲基亚砜，低速摇床震荡10 min 至结晶完全溶解，随后采用酶标仪检测各孔在490 nm 波长处的吸光度值。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡

收集转染48 h 的各组细胞，磷酸盐缓冲液洗涤细胞后，采用结合缓冲液调整细胞浓度为1×106cells/mL。取100 μL 细胞悬液加入到流式管内，分别加入5 μL 的Annexin V-FITC 和5 μL 的PI，避光孵育15 min，补加400 μL 的结合缓冲液，立即采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.7 免疫印迹检测TNFAIP8、cyclin D1、p21、Bcl-2和Bax蛋白的表达水平

收集转染48 h 的各组细胞，采用蛋白提取试剂盒提取各组细胞蛋白，测定蛋白浓度和纯度。取适量蛋白样品和等体积的2×上样缓冲液混匀后，沸水浴5 min 使细胞蛋白变性。取30 μg 蛋白样品上样后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。利用湿法转膜装置将细胞蛋白转移至硝酸纤维素膜，将膜置于5%脱脂奶粉中室温封闭1 h，加入稀释的一抗（1∶500）室温反应2 h，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶2 000）室温反应1 h，利用ECL 发光试剂盒进行显色，凝胶成像系统拍照后，以GAPDH 为内参，图像处理软件分析各目的灰度值。

1.8 统计学处理

采用SPSS18.0 进行统计学分析。所有组均设置3 个平行实验或复孔，重复3 次。数据均采用±s表示，2 组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步组间比较采用SNK-q检验。

2 结果

2.1 miR-671-5p 和TNFAIP8 在胰腺癌组织中的表达

胰腺癌组织miR-617-5p、TNFAIP8 mRNA、TNFAIP8 的表达分别为1.00±0.06、1.01±0.07、0.23±0.03，癌旁组织分别为0.48±0.05、3.05±0.29、0.61±0.06。与癌旁组织比较，胰腺癌组织miR-617-5p 的表达水平降低，TNFAIP8 mRNA 和TNFAIP8 的表达水平升高（图1），差异均有统计学意义（P＜0.01）。

图1 胰腺癌组织TNFAIP8 蛋白表达Fig 1 TNFAIP8 protein expression in pancreatic cancer

2.2 miR-671-5p 和TNFAIP8 在胰腺癌capan-1 细胞和正常胰腺细胞HPDE6C7 中的表达

正常胰腺导管上皮细胞HPDE6C7 中miR-617-5p、TNFAIP8 mRNA、TNFAIP8 的表达分别为1.00±0.07、1.00±0.05、0.21±0.02，胰腺癌细胞capan-1 中的表达分别为0.56±0.05、2.74±0.27、0.55±0.05，差异均有统计学意义（图2）（P＜0.01）。

图2 胰腺癌细胞TNFAIP8 蛋白表达Fig 2 TNFAIP8 protein expression in pancreatic cancer cells

2.3 miR-671-5p 靶向调控TNFAIP8 的表达

生物信息学数据库StarBase 靶基因预测显示，miR-671-5p 可与TNFAIP8 的3′UTR 区域存在部分连续互补结合位点（图3A）。双荧光素酶报告基因实验显示，与miR-NC 和WT-TNFAIP8 共转染组比较，miR-371-5p mimics 和WT-TNFAIP8 共转染组capan-1 细胞荧光素酶活性（0.48±0.05 比1.03±0.09）显著降低（P＜0.01）；与miR-NC 和WT-TNFAIP8 共转染组比较，miR-371-5p mimics和WT-TNFAIP8 共转染组capan-1 细胞荧光素酶活性（1.02±0.08 比1.04±0.09）变化无统计学意义。免疫印迹验证miR-671-5p 和TNFAIP8 的调控关系显示，与miR-NC 组比较，miR-671-5p 组TNFAIP8蛋白的表达水平（0.24±0.03 比0.58±0.05）显著降低；与anti-miR-NC 组比较，anti-miR-671-5p 组TNFAIP8 的表达水平（0.89±0.08 比0.56±0.04）显著升高（P＜0.01，图3B）。以上结果说明miR-671-5p 靶向负调控TNFAIP8 表达。

2.4 miR-671-5p 过表达对胰腺癌capan-1 细胞增殖和凋亡的影响

结果显示（图4，表1），与miR-NC 组比较，miR-671-5p 组capan-1 细胞miR-671-5p 的表达量显著增加，cyclin D1 和Bcl-2 蛋白的表达量显著降低，p21 和Bax 蛋白的表达量显著升高，细胞在转染48、72 h 时间点细胞活力显著降低，细胞凋亡率显著升高（P＜0.01）。

图4 miR-671-5p 过表达对胰腺癌capan-1 细胞增殖和凋亡的影响Fig 4 Effect of miR-671-5p overexpression on proliferation and apoptosis of pancreatic cancer capan-1 cells

表1 miR-671-5p 过表达对胰腺癌capan-1 细胞增殖和凋亡的影响（n=9，±s）Tab 1 Effect of overexpressing miR-671-5p on proliferation and apoptosis of pancreatic cancer capan-1 cells（n=9，±s）

**P＜0.01 vs miR-NC

Group miR-671-5p OD 490 Apoptosis rate（%）Cyclin D1 protein p21 protein Bcl-2 protein Bax protein 24 h 48 h 72 h miR-NC 1.01±0.09 0.36±0.04 0.71±0.06 1.12±0.09 7.36±0.74 0.71±0.06 0.23±0.03 0.68±0.06 0.36±0.03 miR-671-5p 2.87±0.28** 0.33±0.03 0.44±0.04** 0.57±0.05** 21.44±2.13** 0.29±0.03** 0.61±0.06** 0.27±0.03** 0.81±0.07**

2.5 干扰TNFAIP8 表达对胰腺癌capan-1 细胞增殖和凋亡的影响

结果显示（图5，表2），与si-NC 组比较，si-TNFAIP8 组capan-1 细胞TNFAIP8 蛋白的表达量显著降低，cyclin D1 和Bcl-2 蛋白的表达量显著降低，p21 和Bax 蛋白的表达量显著升高，细胞在转染48、72 h 时间点细胞活力显著降低，细胞凋亡率显著升高（P＜0.01）。

图5 干扰TNFAIP8 表达对胰腺癌capan-1 细胞增殖和凋亡的影响Fig 5 Effect of interfering with TNFAIP8 expression on proliferation and apoptosis of pancreatic cancer capan-1 cells

表2 干扰TNFAIP8 表达对胰腺癌capan-1 细胞增殖和凋亡的影响（n=9，±s）Tab 2 Effect of interfering with TNFAIP8 expression on proliferation and apoptosis of pancreatic cancer capan-1 cells （n=9，±s）

**P＜0.01 vs si-NC

Group TNFAIP8 protein OD 490 Apoptosis rate（%）cyclin D1 protein p21 protein Bcl-2 protein Bax protein 24 h 48 h 72 h si-NC 0.63±0.06 0.37±0.04 0.73±0.06 1.15±0.09 6.87±0.69 0.73±0.07 0.22±0.03 0.69±0.06 0.37±0.03 si-TNFAIP8 0.21±0.03** 0.36±0.03 0.51±0.05** 0.66±0.06** 18.36±1.85** 0.34±0.03** 0.58±0.05** 0.31±0.03** 0.76±0.07**

2.6 TNFAIP8 过表达逆转了miR-671-5p 过表达对胰腺癌capan-1 细胞增殖和凋亡的作用

结果显示（图6，表3），与miR-NC 组比较，miR-671-5p 组capan-1 细胞TNFAIP8、cyclin D1 和Bcl-2 蛋白的表达量显著降低，p21 和Bax 蛋白的表达量显著升高，细胞在转染48、72 h 时间点细胞活力显著降低，细胞凋亡率显著升高；与miR-671-5p+pcDNA 组比较，miR-671-5p+pcDNA-TNFAIP8组capan-1 细胞TNFAIP8、cyclin D1 和Bcl-2 蛋白的表达量显著升高，p21 和Bax 蛋白的表达量显著降低，细胞在转染48、72 h 时间点细胞活力显著升高，细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）。

3 讨论

胰腺癌是一种高度致命性恶性肿瘤，其死亡率与发病率相当[8]。近年来，尽管在胰腺癌的治疗上付出了很大努力，但大多数患者预后仍然较差。因此，了解调控胰腺癌细胞增殖和凋亡的分子机制，开发新的、有效的胰腺癌治疗方法是目前医学临床亟待解决的重大课题。

miRNA 在多种人类癌症包括胰腺癌的发生发展中发挥重要作用[9]。已有研究证实miR-671-5p在人类癌症进展起关键作用。miR-671-5p 在食管鳞状细胞癌组织中下调表达，过表达miR-671-5p抑制食管鳞状细胞癌细胞的增殖、克隆形成和迁移[10]。miR-671-5p 通过下调FOXM1 的表达抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭及上皮间质转化，其还可通过降低DNA 修复能力，提高乳腺癌细胞对紫外线和化疗的敏感性[11]。此外，miR-671-5p 的表达失调与儿童脊索瘤的进展具有一定相关性[12]。本研究结果显示，胰腺癌组织中miR-671-5p 的表达水平显著低于癌旁组织，过表达miR-671-5p 可抑制胰腺癌细胞增殖，诱导细胞凋亡。检测增殖和凋亡相关蛋白显示，过表达miR-671-5p 可抑制促增殖蛋白cyclin D1 和抗凋亡蛋白Bcl-2 表达，促进增殖抑制蛋白p21 和促凋亡蛋白Bax 表达。以上研究说明miR-671-5p 通过抑制细胞增殖能力和诱导细胞凋亡，在胰腺癌中发挥抑癌作用。

图6 TNFAIP8 过表达逆转了miR-671-5p 过表达对胰腺癌capan-1 细胞增殖和凋亡的作用Fig 6 Overexpressing TNFAIP8 reversed the effect of miR-671-5p overexpression on pancreatic cancer capan-1 cell proliferation and apoptosis

表3 TNFAIP8 过表达逆转了miR-671-5p 过表达对胰腺癌capan-1 细胞增殖和凋亡的作用（n=9，±s）Tab 3 TNFAIP8 overexpression reversed the effect of miR-671-5p overexpression on pancreatic cancer capan-1 cell proliferation and apoptosis （n=9，±s）

*P＜0.05 vs miR-NC；#P＜0.05 vs miR-671-5p+pcDNA

Group TNFAIP8 protein OD 490 Apoptosis rate（%）Cyclin D1 protein p21 protein Bcl-2 protein Bax protein 24 h 48 h 72 h miR-NC 0.64±0.06 0.35±0.04 0.74±0.06 1.13±0.09 7.36±0.73 0.72±0.07 0.24±0.03 0.67±0.06 0.35±0.03 miR-671-5p 0.22±0.03* 0.32±0.03 0.47±0.04* 0.62±0.06* 20.66±2.08* 0.30±0.03* 0.62±0.06 0.28±0.03 0.82±0.08 miR-671-5p+pcDNA 0.20±0.03 0.31±0.03 0.44±0.04 0.57±0.05 21.98±2.23 0.28±0.03 0.64±0.05 0.26±0.03 0.83±0.07 miR-671-5p+pcDNA-TNFAIP8 0.53±0.05# 0.34±0.03 0.63±0.05# 0.93±0.08# 12.69±1.24# 0.61±0.05# 0.35±0.03# 0.55±0.05# 0.46±0.04#

TNFAIP8，也被称为NDEN 或SCCS2，编码一种抗凋亡蛋白。研究显示TNFAIP8 在宫颈癌[13]和卵巢癌[14]等多种人类恶性肿瘤中表达上调并具有致癌作用。TNFAIP8 的表达上调与食管鳞癌患者的肿瘤分期、浸润程度、远端转移、淋巴和静脉侵犯以及不良预后显著相关[15]。TNFAIP8 还影响上皮性卵巢癌、非小细胞肺癌对铂类化疗药的耐药性[16-17]。TNFAIP8 还促进前列腺癌细胞的生存和对多西他赛的耐药[18]。本研究结果显示，胰腺癌组织中TNFAIP8 的表达水平显著升高，与前人研究结果相吻合[19]。进一步研究证实TNFAIP8 是miR-671-5p 的直接靶点，且miR-671-5p 在转录后水平负调控TNFAIP8 表达。干扰TNFAIP8 表达抑制胰腺癌细增殖并诱导细胞凋亡，过表达TNFAIP8 可逆转miR-671-5p 过表达对胰腺癌细胞增殖、凋亡及其相关蛋白表达的影响。提示miR-671-5p 通过下调TNFAIP8 表达在胰腺癌中发挥抑癌基因作用。由于TNFAIP8 在胰腺癌[7]和肺癌[20]等恶性肿瘤的侵袭转移中发挥促进作用，今后将探讨miR-671-5p 调控TNFAIP8 表达对胰腺癌侵袭转移的影响。

综上所述，miR-671-5p 在胰腺癌组织中呈低表达。miR-671-5p 通过靶向TNFAIP8 抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，从而在胰腺癌中发挥抑癌基因作用。本研究提示miR-671-5p 可能是胰腺癌早期诊疗的潜在靶点。