早期运动训练对脑梗死后缺血半暗带GAP-43、Nogo-A及GFAP表达的影响*

张维文 张方圆 方 玲 王晓莉 魏 琰

（衡水市人民医院神经内科，衡水 053000）

缺血性中风急性期会造成轴突迅速而大量的损失，据报道其治疗每延迟1 min，就会导致7 英里的轴突丢失[1]。早期轴突丢失是由于原发缺血性损伤引起的钙信号激活蛋白水解酶和下游信号级联反应；第2 阶段轴突进行性损伤发生在中风亚急性期，急性期幸存轴突由于轴突-胶质接触和轴突能量代谢紊乱将发生轴突变性[2]。轴突再生、神经重塑及神经环路重建对脑梗死遗留神经功能障碍的恢复起着至关重要的作用。中枢神经系统中损伤轴突的再生需具备2 个因素：激活神经元中轴突生长基因表达和信号通路等内在因素，抑制影响轴突再生的负性外源因素，如胶质瘢痕、轴突再生抑制分子及信号通路等[3]。研究已表明外源性拮抗神经突起生长抑制因子A（neurite outgrowth inhibitor-A，Nogo-A）表达能够增强轴突再生和神经元可塑性，改善脑梗死后神经功能障碍[4]。最新研究表明大鼠脑梗死后，电刺激小脑顶核区域可上调轴突生长相关蛋白（growth associated protein-43，GAP-43）的表达，进而促进大鼠运动功能的恢复[5]。本研究应用线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型，探讨跑台运动训练是否可调控缺血半暗带区GAP-43 与Nogo-A、神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）的表达，促进轴突再生和神经功能恢复。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF 级雄性成年Wistar 大鼠90 只，8 周龄，体质量（250～280）g，由北京维通利华生物技术有限公司提供。按随机数字表法分为假手术组、模型组、训练组，每组30 只。每组依据2 个时间点（14 d，28 d）将动物分为 2 个亚组，每个亚组15 只动物。

1.2 药品和仪器

兔抗大鼠GAP-43、Nogo-A和GFAP多克隆抗体购自美国Cell Signaling公司；兔抗大鼠β-actin单克隆抗体购自北京博奥森生物有限公司；蛋白提取试剂盒购自上海碧云天生物技术公司；SABC免疫组织化学检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；BCA试剂盒与DAB显色试剂盒购福州迈新生物有限公司；2，3，5一氯化三苯基四氮唑购自美国Sigma公司；Solarbio苏木精-伊红染色试剂盒 购自北京索莱宝公司。电动跑台仪（Exer3/6R型，美国哥伦布仪器有限公司）；大鼠脑立体定向仪（上海江湾医疗器械厂）；微量注射器（杭州科晓化工仪器设备有限公司）；光学显微镜（日本Olympus公司）。

1.3 脑梗死模型制备

参照文献[6]采用线栓法制备左侧大脑中动脉闭塞模型。采用 0.8%戊巴比妥钠30 mg/kg 腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功后将大鼠仰卧固定于台上，分离左侧颈总动脉，穿线备用；依次分离左侧颈外动脉、颈内动脉并依次结扎；动脉夹夹闭颈内动脉远心端；在颈内动脉与颈外分叉的近心端剪T 型切口，将线栓轻插入颈内动脉，当感到有阻力时，停止插线，距颈内动脉与颈外动脉分叉处约（18.5±1.5）mm，证明线栓头端已经进入大脑中动脉处，扎紧备线，消毒、缝合皮肤。

1.4 跑台运动训练

手术前各组研究大鼠均在电动跑台仪上进行适应性跑步训练3 d。运动训练组大鼠于脑梗死模型制备成功后24 h 给予跑台训练，每天训练30 min。电动平板斜度为0，第1 天运动速度为4 m/min，第2 天增加至 8 m/min，第3 天增加至12 m/min，然后保持该速度分别训练至造模后14 d 及28 d。假手术组及模型组每日亦置于跑台上30 min，但不进行跑步运动。

1.5 神经功能缺损评分

各组大鼠术后14 d、28 d，采用改良神经功能缺损评分法（modified neurological severity score，mNSS） 评估大鼠神经功能缺损程度，包括运动、感觉、平衡、反射等多个项目，总分为0～18 分，分数越高表明神经功能缺陷更严重。

1.6 平衡木试验

各组大鼠术后14 d，28 d，采用平衡木行走实验来评估大鼠脑梗死后的肢体运动功能障碍。记录大鼠走完平衡木所需要的脚步总数与错误脚步数，计算大鼠平衡木行走错误百分率=错误脚步数/脚步总数（正确脚步数与错误脚步数总和）。错误百分率越大说明大鼠运动功能缺损越严重。

1.7 脑梗死体积测定

用2，3，5-三苯基氯化四氮唑 （TTC） 染色法检测大鼠脑梗死体积，大鼠麻醉后迅速断头取脑，冠状切片每组6 片（2 mm），TTC 染液中室温染色30 min。使用Image J 分析软件分析梗死体积百分比。依据公式：脑梗死百分比=脑梗死体积/ 脑片体积×100%。

1.8 H-E 染色

麻醉处死大鼠取组织，10% 甲醛溶液固定48～72 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续冠状切片（5 μm），石蜡切片脱蜡至水，苏木精染核10 min，自来水冲洗，1%盐酸乙醇分化1 min，水洗返蓝2 h，伊红染浆5 min，水洗脱水透明后中性树胶封片。

1.9 免疫印迹检测

称取100 mg 血肿周围组织，加入蛋白裂解液1 mL 和蛋白酶抑制剂中裂解，低温组织匀浆后静置30 min，低温离心留取上清液。用BCA 试剂盒进行蛋白定量浓度测定，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，半干法电转移至PVDF 膜上，PVDF 膜以5%BSA 封闭，分别滴加兔抗大鼠GAP-43、Nogo-A 和GFAP 多克隆抗体（均1∶500）、兔抗大鼠β-actin 单克隆抗体（1∶1 000）4℃孵育过夜。次日洗膜后滴加lgG-HRP 抗体（1∶5 000），室温孵育2 h。ECL 化学发光液曝光，扫描并测定目标蛋白吸光度值，与内参β-actin 比值后，计算目标蛋白的相对表达量。

1.10 统计学处理

所有数据采用SPSS13.0软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，采用单因素方差分析和t检验。

2 结果

2.1 跑台训练对大鼠神经功能缺损影响

mNSS 结果显示，假手术组大鼠mNSS 评分为0 分，提示神经功能无缺损。14 d 与28 d 模型组大鼠mNSS 评分显著高于相应时间点的假手术组（P＜0.05），评分在7～12 分之间，属于中度神经功能缺损。与模型组相比，跑台训练组大鼠的mNSS 评分明显降低（P＜0.05），但仍高于假手术组（图1）。

图 1 各组大鼠神经功能评分的比较Fig 1 Comparison of neurological dysfunction of rats in each group

2.2 跑台训练对大鼠行为学障碍的影响

在脑梗死后14、28 d，应用大鼠平衡木行走试验检测大鼠行为学改变。脑梗死大鼠患侧前肢和后肢平衡木的错误百分率明显高于假手术组（P＜0.05），提示严重的运动功能障碍。与模型组相比，跑台训练组大鼠的前肢和后肢行走错误率明显降低（P＜0.05）（图2）。

图 2 各组大鼠患侧前肢、后肢运动功能的比较Fig 2 Comparison of affected forelimb and hindlimb function of rats in each group

2.3 跑台训练对大鼠脑梗死体积的影响

假手术组大鼠脑组织中未见梗死灶。与假手术组相比，模型组大鼠14 d 及28 d 均有不同程度的梗死灶形成（P＜0.05）。与模型组相比，跑台训练后大鼠脑梗死体积百分比显著降低（P＜0.05）。结果表明运动训练可以缩小脑梗死体积，促进脑损伤恢复（图3）。

图 3 各组大鼠脑梗死体积的比较Fig 3 Comparison of cerebral infarct volume of rats in each group

2.4 跑台训练对缺血半暗带神经元形态的影响

假手术组皮层神经元排列整齐有序，神经细胞结构清晰，细胞核蓝染，大而圆。模型组大鼠缺血半暗区，细胞层次排列紊乱，组织间质水肿，大量细胞坏死，锥体细胞核固缩、深染甚至溶解。跑台训练组大鼠缺血半暗带脑组织间质水肿减轻，细胞数量增加且形状较为完整（图4）。

2.5 跑台训练对轴突生长促进因子与抑制因子的调控作用

假手术组大鼠大脑皮质区呈现低水平GAP-43的表达，且高水平的Nogo-A 表达，在正常成年大鼠脑组织中两者的表达模式可抑制轴突生长，维持突触稳定性。与假手术组比较，模型组大鼠缺血半暗带GAP-43 表达升高，Nogo-A 蛋白水平降低（P＜0.05），此变化可促进轴突出芽与延伸，启动自我修复机制。与模型组相比，跑台训练组大鼠GAP-43 表达进一步上调，Nogo-A 蛋白水平进一步下调（P＜0.05），更大强度促进脑梗死后的轴突再生和神经重构（图5）。

2.6 跑台训练对星形胶质细胞增生的调控作用

GFAP是星形胶质细胞特异性标志蛋白，星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多的细胞，所以在假手术组大鼠有较高的基础表达水平。模型组14、28 d大鼠缺血半暗带GFAP表达较相应时间点假手术组显著增多（P＜0.05）。与相应时间点模型组相比，跑台训练组大鼠GFAP表达明显降低（P＜0.05），抑制星形胶质细胞增生及胶质瘢痕形成，易于轴突再生（图6）。

图 4 各组大鼠14 d（A1～C1）、28 d（A2～C2）大脑皮质组织形态学比较，×400Fig 4 Comparison of cerebral cortex morphology of rats in each group at 14 d（A1-C1） and 28 d（A2-C2），×400

图 5 大鼠大脑皮质GAP-43 与Nogo-A 的蛋白表达Fig 5 Expression of GAP-43 and Nogo-A protein in the cortex of rats

图 6 大鼠大脑皮质GFAP 的蛋白表达Fig 6 Expression of GFAP protein in the cortex of rats

3 讨论

脑梗死后期遗留持久严重的认知和神经功能障碍尚无特效治疗方案。有研究表明轴突再生是大脑损伤修复的一个重要方面，有助于自发性脑缺血后神经功能障碍的改善[7]。因此寻找促进脑梗死缺血半暗带区轴突再生和突触形成，恢复神经功能的治疗方法至关重要。本研究采用线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型，探讨跑台运动训练对脑梗死缺血半暗带轴突再生及大鼠神经功能的影响。实验数据显示：跑台训练后脑梗死大鼠的神经功能缺损评分明显降低，神经元损伤程度降低，运动功能障碍恢复。同样有文献表明运动训练可以显著改善缺血性脑损伤诱导的运动、感觉及认知功能障碍，其机制与调控mRNA 翻译、细胞骨架重构及突触可塑性相关[8]。另外早期运动训练可以调节脑水肿、细胞凋亡、氧化损伤及干细胞等，从而对大脑发挥神经保护作用[9]。本研究结果及如上文献证实了脑梗死后早期运动训练的积极治疗效果。但是也有证据表明脑缺血损伤后早期给予运动训练可以增加细胞应激反应及大量炎症因子的释放，扩大脑损伤[10]。针对脑缺血后的早期炎症反应，和造模所带给动物的急性应激状态，早期运动干预有可能会加重早期神经炎性损伤。但是就与轴突再生、突触形成、神经环路重建等相关的神经功能恢复的远期效应考虑，早期给予运动训练可能发挥积极的神经保护作用。本研究主要探讨了早期跑台训练对脑梗死大鼠缺血半暗带区轴突再生的调控作用。

在成熟的中枢神经系统中，神经元内在生长能力被抑制以稳定突触环路。在轴索损伤后，启动内在分子生长程序，压制生长抑制环境，可唤起轴突再生能力。GAP-43 在神经元发育和突触形成过程中呈高表达，参与轴突再生，突触可塑性及学习记忆功能的调控[11]。GAP-43 被认为是缺血后神经元损伤的早期敏感标志物，在啮齿类模型中已经证实梗死周围区域的GAP-43 水平明显升高[12]。与本实验研究结果一致，免疫印迹结果显示：在脑梗死后14 d 与28 d 缺血半暗带脑组织GAP-43 表达量明显高于假手术组。1 项重要临床研究显示在28 名缺血性中风患者的脑脊液中GAP-43 浓度也显著升高，并与中风的严重程度和白质缺损萎缩体积呈正相关[13]。本研究结果显示大鼠脑梗死早期给予跑台训练干预持续至14 d 或28 d 均可显著上调缺血半暗带GAP-43 的水平。

Nogo是抑制神经再生的基因，可翻译3种主要蛋白质Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C，但只有Nogo-A具有强大的轴突生长抑制活性，且特异性分布在中枢神经系统[14]。在缺血性中风小鼠模型中，应用中性抗体抑制Nogo-A和Nogo-A敲除小鼠可增强轴突的再生及延伸，修复损伤神经元，改善神经功能障碍[15-16]。本研究结果表明，脑梗死可诱导Nogo-A蛋白在缺血半暗带区呈现高表达，Cheatwood 等[17]报道在28 d MCAO大鼠模型中，高表达的Nogo-A主要定位在缺血皮质的锥体神经元和中间神经元。同时早期跑台训练可以显著降低缺血诱导的Nogo-A蛋白高表达。这样可以抑制不利于轴突再生的外在环境干扰，通过GAP-43启动内在再生途径。

星形胶质细胞是中枢神经系统中最丰富的细胞类型，在缺血性脑损伤病理进程中扮演多重角色：首先通过释放神经营养因子和抗兴奋毒性效应限制脑梗死面积的扩大；其次产生大量的神经炎性因子加速缺血诱导的脑损伤，再者胶质细胞增生形成的瘢痕阻隔轴突再生，不利于神经功能的修复[18]。GFAP属于细胞骨架中的中间丝成分，是星形胶质细胞的特异性标志物。据报道缺血性脑损伤后星形胶质细胞反应性胶质化，GFAP及轴突生长抑制分子的表达增加[19]。在GFAP 和波形蛋白双敲除小鼠中，可以抑制缺血损伤后的反应性胶质化和胶质瘢痕形成，进而促进轴突再生和小鼠运动功能恢复[20]。本实验表明，早期运动训练可以显著抑制缺血半暗带皮质中GFAP的表达量，抑制星形胶质细胞的增生及胶质瘢痕形成，促进轴突再生和神经重构。

综上所述，本研究证实早期运动训练可以缩小脑梗死面积，减弱神经元损伤程度，并促进脑梗死大鼠神经功能的恢复。其机制可能通过上调缺血半暗带区轴突生长正性调控因子GAP-43 表达，下调轴突生长负性调控因子Nogo-A 和GFAP，促进轴突再生和神经可塑性，改善神经功能。