白藜芦醇对H9C2心肌细胞Kv2.1钾通道的影响*

黄晓燕

白藜芦醇是天然植物中提取的一种非黄酮类多酚化合物,具有抗氧化、抗炎症、抗凋亡、抗肿瘤等药理作用[1－2]。动物实验表明白藜芦醇具有抗心律失常作用[3]。Kv2.1 是电压门控性钾离子通道(voltage-gated potassium channels,Kv)的成员之一[4],广泛表达于神经元和啮齿类动物心肌细胞,是心肌动作电位3相复极的主要离子流延迟整流钾电流(delayed rectifier K＋current,IK)的主要分子基础。笔者研究白藜芦醇对H9C2大鼠心肌细胞Kv2.1钾通道的影响,进一步探讨其抗心律失常的离子机制。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂 DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)购自美国Thermo scientific 公司;胎牛血清购自Gibco公司;兔抗Kv2.1 多克隆抗体购自Abbkine公司;膜片钳系统及分析软件为美国Axon公司产品。实验药物白藜芦醇购自Sigma公司,配成10 mmol/L母液。

1.2 细胞培养和实验分组 H9C2 大鼠心肌细胞购买自中科院上海细胞库,常规用含10%FBS DMEM 培养基,放置于37 ℃5%CO2培养箱培养。实验分实验组(白藜芦醇干预)和对照组(未加入白藜芦醇)。

1.3 Kv2.1 钾通道电流的研究 室温下(24～26℃)采用全细胞膜片钳技术观察Kv2.1电流。电极外液配方(mmol/L):NaCl 60、Na-gluconate 80、CaCl20.1、MgCl21、KCl 5、HEPES 10、glucose 10(用NaOH 将p H 调 至7.4)。电 极 内 液 配 方(mmol/L):MgCl20.5、KCl 30、K-gluconate 110、EGTA 10、HEPES 5、Na2ATP 5、GTP-tris 1(用KOH 将p H 调至7.2)。灌注电极内液后电极入水电阻为3～5 mΩ;刺激程序由Clampex 9.2 软件和Axon 700B 放大器共同完成,信号经过Axon 700B放大器和A/D 转换后储存于计算机中。

1.4 Kv2.1钾通道蛋白表达的检测 收集对照组和实验组的细胞,加入预冷RIPA 细胞裂解液。取细胞裂解上清液20μl,点样于8%SDS-PAGE,电泳后电转至PVDF膜。兔抗Kv2.1多克隆抗体1∶500 稀释,4 ℃孵育过夜。二抗采用辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体,1∶1 000 稀释,室温孵育2 h,最后在化学发光系统中观察拍照。

1.5 统计学处理 采用pCLAMP Ver.9.2 软件(Axon Instruments,California,USA)编辑刺激程序、记录电流及分析和测量原始数据。Excel和Origin7.5 软件对采集到的数据进行统计、拟合和作图。将采集到的原始数据除以膜电容,得到电流密度值,相对各激活电压,采用Origin7.5 软件作图,得到电流密度-电压图。药物的半数最大效应浓度(EC50)用Hill方程E＝Emax/[1＋(EC50/C)n]进行拟合。通道的激活电流通过单指数方程拟合,得到不同去极化电压下的激活时间常数。稳态失活电流经最大电流标准化,用Boltzmann 方程I/Imax ＝1－ {1＋exp[(Vt－V1/2)/k]}－1拟合,得到稳态失活拟合图(Imax为最大通道电流,Vt为测试电压,V1/2为半失活最大电压,k 为斜率因子),以V1/2和k 评价药物对失活过程的影响。计量资料以均数±标准差表示,用药前后比较采用t检验,以P＜0.05 为差异有显著性。

2 结果

2.1 白藜芦醇对Kv2.1通道电流的作用 为评价白藜芦醇对Kv2.1通道电流的时间依赖性和浓度依赖性,采用以下刺激方案:细胞钳制在－60 m V,测试电压＋40 m V 并持续300 ms,然后去极化到－40 m V 持续100 ms。白藜芦醇分别干预H9C2细胞12、24、48h,图1A 显示:与对照组相比,白藜芦醇能够明显增强Kv2.1 通道电流,具有时间依赖性。1、5、20、100μmol/L 白藜芦醇分别干预24 h,以药物浓度对数为横坐标,相对电流密度为纵坐标,得到浓度效应曲线,用Hill方程进行拟合。浓度效应关系见图1B,EC50为14.02μmol/L。后续实验均采用20μmol/L 白藜芦醇干预H9C2细胞24 h作为实验组。

2.2 两组Kv2.1通道电流密度的比较 记录激活电流刺激方案为:细胞钳制在－60m V,测试电压从－70 m V,以10 m V 的阶跃,刺激到＋50 m V,持续300 ms;然后去极化到－40 m V,持续100 ms。对照组和实验组Kv2.1通道电流曲线图(图2A、B),电流密度-电压图(图2C),可以看到白藜芦醇能够明显增强Kv2.1 通道电流,具有电压依赖性。结果显示,＋50 m V 处,白藜芦醇干预前后电流密度分别为(34.86±7.71)p A/p F 和(60.82±1.68)p A/p F,增加了74.5%(n＝6,P＜0.05)。

图2 两组Kv2.1通道电流曲线图和电流密度的比较

2.3 白藜芦醇对Kv2.1通道电流激活特性的影响 对图2的Kv2.1通道电流曲线图,通过单指数方程拟合得到激活时间常数。从图3 可以看到,对照组的激活时间常数在＋10 m V 处为(21.82±1.40)ms,而在＋50 m V 处变为(4.19±0.38)ms,实验组通道＋50 m V 处的激活时间常数由(4.19±0.38)ms变为(2.70±0.22)ms。可见Kv2.1 通道激活的时间进程具有电压依赖性,白藜芦醇加速了Kv2.1通道的激活进程。

图3 两组Kv2.1通道电流激活特性的比较

2.4 白藜芦醇对Kv2.1电流失活特性的影响 细胞钳制在－80 m V,测试电压以10 m V 阶跃从－100 m V 刺激到30 m V,持续时间6 s;然后测试电压钳制在40 m V 时记录电流(见图4)。两组稳态失活电流曲线图见图4A、B,图4C为稳态失活电流经最大电流标准化,用Boltzmann 方程拟合,得到稳态失活拟合图,从而求出V1/2和k。结果显示,对照组与实验组半失活最大电压V1/2分别为(－28.60±2.23)m V 和(－13.34±1.15)m V(n＝6,P＜0.05),k 值分别为(11.68±2.06)m V 和(9.72±1.00)m V(n＝6,P＞0.05)。可见白藜芦醇减慢了Kv2.1通道的失活过程,且白藜芦醇导致Kv2.1通道的失活曲线右移了15.26 m V,但是k 值却没有明显变化。

2.5 两组Kv2.1钾通道蛋白表达的比较 与对照组相比,实验组Kv2.1 通道蛋白条带增强,并且实验组目的条带与内参GAPDH 条带的相对比值明显高于对照组(P＜0.05,图5)。

3 讨论

有研究报道,白藜芦醇能够通过增加血管内皮细胞的高电导钙敏感性钾通道的活动,使细胞膜去极化,导致钙通道失活降低细胞内游离钙,进而舒张血管[5]。有研究发现,白藜芦醇与格列本脲联合应用,通过恢复kir6.2亚基蛋白表达和钾离子通道,从而减轻糖尿病大鼠缺血再灌注诱发的心律失常[3]。本研究首先证实白藜芦醇对Kv2.1通道电流具有增强作用,呈时间依赖性和浓度依赖性,其EC50为14.02μmol/L。白藜芦醇对Kv2.1电流的增强作用还具有电压依赖性,＋50 m V 处Kv2.1通道电流密度比干预前增加了74.5%,可见白藜芦醇能够正向调控Kv2.1通道电流。在获得性长QT 综合征动物模型中,白藜芦醇通过显著降低动作电位持续时间、QT 间期和复极离散度,从而发挥良好的抗心律失常作用[6]。本实验结果与之相符合。

图4 两组Kv2.1通道电流失活特性的比较

图5 两组Kv2.1钾通道蛋白条带

Kv通道的重要特性之一就是电压敏感性,可被膜电位去极化而激活。本研究表明,随着细胞膜去极化程度的增加,Kv2.1 通道的激活加 快,Kv2.1 通道激活时间常数具有电压依赖性,并且白藜芦醇减少了Kv2.1 通道的激活时间常数,加快了该通道的激活过程。Kv2.1 通道是失活相对较慢的一种钾离子通道。本研究发现当测试电压小于－80 m V 时,Kv2.1 通道基本没有失活,从－80 m V 开始Kv2.1通道逐渐失活,当电压大于＋20 m V 时,该通道基本失活。白藜芦醇干预后使得Kv2.1 通道的失活曲线右移了15.26 m V,这将导致由Kv2.1介导的延迟整流钾电流在动作电位复极化阶段灭活减慢,缩短心肌细胞动作电位时程,增强其兴奋性。

本研究还发现白藜芦醇能促进Kv2.1 通道蛋白表达,可见白藜芦醇可能主要通过上调蛋白表达,影响Kv2.1通道进而改变电流,一定程度上揭示白藜芦醇抗心律失常的作用机制。