基于网络药理学探讨黄芪六君子汤治疗新冠肺炎恢复期的作用机制

汪宗清，聂红科，李青璇，王兴强，汤小虎,*

(1.云南中医药大学，云南 昆明 650500;2.云南中医药大学第一附属医院， 云南 昆明 650032)

新冠肺炎(COVID-19)是由新型冠状病毒(2019-nCoV)感染引起的传染性疾病，2019年12月在中国武汉爆发，随后疫情迅速蔓延至全国，在其他国家和地区也大量出现。截至2020年3月30日，全球累计确诊70余万例，我国累计确诊82 505例，治愈出院75 949例，现有确诊3243例。目前疫情在我国的蔓延势头已逐渐放缓，但国外疫情仍十分严峻，全球疫情防控形式不容乐观。随着符合出院标准的新冠肺炎患者逐日增多，恢复期的中医治疗应受到关注。为避免恢复期患者症状加重或再度出现核酸检测转阳性，全国各省市相继推出了新冠肺炎恢复期中医康复指南，北京中医药学会肺系病专业委员会在广泛听取院士、国医大师、名老中医、温热病大家、肺病专家等临床专家尤其是一线医生等方面意见的基础上，制定发表了《新型冠状病毒肺炎恢复期中医药综合干预方案专家指导意见(草案)》[1]，提出正虚邪恋是新冠肺炎恢复期之病机根本，因此中医药综合干预除了清除残留之病邪外，还应当顾护机体正气，针对恢复期患者肺脾气虚之证，推荐黄芪六君子汤作为基础方，这与国家卫生健康委员会和国家中医药管理局联合发布的《新冠肺炎诊疗方案(试行第七版)》[2]推荐处方基本相同。

国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第三版)》首次明确了新冠肺炎属于中医“疫”病范畴[3]，致病因素为湿毒，核心病机为湿毒壅肺、阻遏气机，病程中湿毒之邪蕴于脏腑、困阻气机，且患者久卧病榻，肢体欠伸展，过分忧思病情而气机闭郁，肺脾两伤。总之，新冠肺炎恢复期病机以正虚为本，邪气留扰为标，《医学集成》[4]言“病后，调脾进食”。黄芪六君子汤以六君子汤为底，六君子汤原多用于脾胃病的治疗，亦为培土生金法代表方, 可用于脾虚水液运化失常, 聚水液而成痰湿, 症见咳嗽、咳痰,并夹杂脾虚证候的肺系疾病。塔娜等[5]运用加味六君子汤治疗患儿过敏性咳嗽稳定期(中医辨证属肺脾气虚)，发现其明显有效。杨靖罡等[6]运用六君子汤加减治疗老年患者的慢性肺部感染(脾肺气虚证),发现可改善患者各方面症状以及提高患者生活质量。林水玉[7]通过临床实验研究发现，六君子汤可明显改善慢性阻塞性肺疾病肺脾气虚型患者的临床症状及肺功能,能减低IL8，TNFα等细胞因子的水平。黄芪六君子汤由六君子汤加黄芪、紫苏、桔梗组成，具有健脾益肺、燥湿化痰的功效，针对新冠肺炎恢复期患者正虚为本，邪留为标，可达到标本同治，肺脾双补的功效。本研究基于网络药理学，整理分析黄芪六君子汤与新冠肺炎在有效成分、作用靶点及通路等方面的联系，探讨其潜在的作用机制，以期为治疗新冠肺炎恢复期肺脾气虚证患者提供依据。

1 材料与方法

1.1 数据库与软件

数据库和软件主要包括:TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)、GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、Uniport数据库(http://www.uniprot.org/)、STRING数据库(https://string-db.org/)、GO数据库(http://geneontology.org/)、KEGG数据库(https://www.kegg.jp/)、Cytoscape3.7.2软件(https://cytoscape.org/)、R3.6.2软件(https://mirrors.tongji.edu.cn/CRAN/)。

1.2 黄芪六君子汤的化学成分

通过TCMSP数据库检索黄芪六君子汤9味中药化学成分，其中黄芪、人参、茯苓、白术、陈皮、半夏、紫苏、桔梗筛选条件为口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18的化学成分，甘草符合OB≥50%且DL≥0.18的化学成分作为活性成分，并下载相关化合物的靶点信息。TCMSP数据库查询活性成分相关的靶点，如该数据库中无对应靶点，则进一步通过Pubchem数据库检索活性成分，并查询其所对应的2D结构，保存为SDF文件，上传至Swiss Target Prediction数据库，基于反向分子对接原理进行靶点预测，得到相关的预测靶点。整合以上靶点并去重，最后将筛选得到的所有靶点均经Uniport数据库转化成蛋白质ID格式，以便于后续处理分析。

1.3 新冠肺炎相关靶点的获取及与黄芪六君子汤靶点的映射

通过GeneCards数据库获取疾病相关靶点，以“novel coronavirus pneumonia”作为检索词，将筛选得到的疾病靶点与药物靶点进行映射，获得黄芪六君子汤治疗新冠肺炎的潜在作用靶点。

1.4 活性成分-靶点网络构建

利用Cytoscape软件，将上述得到的活性成分、共同靶基因数据导入软件中，制作活性成分-靶点网络图，并计算其度值(degree)，筛选出核心成分。

1.5 蛋白互相作用网络的构建与核心靶点的分析

将共同靶基因数据导入STRING数据库，限定研究物种为“Homo sapiens”，设置连接评分最小值为0.700，获得蛋白互作关系，导出TSV文件。将文件导入Cytoscape软件进行可视化分析, 并利用cytoHubba插件找到黄芪六君子汤治疗新冠肺炎的关键靶点。

1.6 基因本体 (GO) 功能富集和京都基因与基因组百科全书 (KEGG) 通路富集分析

利用R软件中Bioconductor生物信息软件包，将共同靶基因转换成基因ID，以P<0.05进行关键靶基因的GO和KEGG功能富集分析，GO富集分析又包括生物过程(biological process, BP)、分子功能(molucular function, MF)和细胞组分(cellular component, CC)3个分支。结果以条形图或气泡图形式输出。

1.7 靶点-作用通路网络的构建

将生成的靶点-通路关系文件导入Cytoscape软件，构建靶点-作用通路网络。

2 结果

2.1 黄芪六君子汤活性成分和潜在靶点

通过筛选条件，从TCMSP数据库中共获得黄芪六君子汤145个活性成分。其中白术7个、半夏13个、陈皮5个、茯苓15个、甘草42个、黄芪20个、桔梗7个、人参22个、紫苏14个。整合TCMSP和Swiss Target Prediction数据库预测，以及通过Uniprot数据库校正去重，共获得1618个化合物相关潜在靶点。

2.2 新冠肺炎相关基因

在GeneCards数据库中共找到259个新冠肺炎相关基因，评分排名前5的靶点分别是甘露糖结合凝集素2(MBL2)、人类白细胞抗原组织相容复合物B(HLA-B) 、肿瘤坏死因子(TNF)、甘露聚糖结合凝集素丝氨酸肽酶2(MASP2)、白细胞介素6(IL6)，与黄芪六君子汤活性成分潜在靶点对比，共有37个共同基因。

2.3 活性成分-靶点网络的构建

将黄芪六君子汤治疗新冠肺炎的37个靶基因与筛选出来的活性成分映射，建立活性成分与靶基因对应关系，导入Cytoscape 软件，绘制网络图，特定颜色代表化合物来自不同中药，见图1。并对该网络图中的活性成分的度值进行分析。活性成分的度值表示其所对应的靶点个数，这意味着度值越大，在治疗新冠肺炎的过程中所发挥的作用也越大。其中对应靶点数大于10的活性成分有木犀草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)、川皮苷(nobiletin) 、柚皮素(naringenin)、黄芩素(baicalein)、金合欢素(acacetin)共6个，分别能与18，14，11，11，10，10个靶点连接，对治疗新冠肺炎具有重要的意义，详见表1。表1中选取度值大于等于5的活性成分进行展示。

图1 活性成分-作用靶点网络Fig.1 Components-key targets network

表1 关键化合物的基本信息(度值大于等于5)Table 1 Basic information on the key compounds(The degree value is greater than or equal to 5)

续表1

2.4 核心靶点互作图

将37个共同靶基因导入String数据库中，删除游离蛋白1个，剩余36个蛋白，获得蛋白互作关系。然后导出TSV文件，将蛋白互作关系网络导入Cytoscape软件，运用CytoHubba插件根据节点度值大小进行排列，颜色由深黄变为浅黄，节点由大变小，颜色越深，节点越大，则度值越大，见图2。具体度值见表2，表中平均节点数为21个，有24个蛋白节点数高于均值，丝裂原活化蛋白激酶1/3/8/14(MAPK1/3/8/14)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/8(CASP3/8)、白介素6/1β(IL6/1β)、白蛋白(ALB)，细胞凋亡调节蛋白(BCL2L1)、人前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、原癌基因c-fos(FOS)、RELA原癌基因(RELA)等基因的度值高于25，说明这些节点在整个网络中起着关键的作用，可能是黄芪六君子汤治疗新冠肺炎的关键靶点。

图2 Cytoscape蛋白互作网络 Fig.2 PPI network of cytoscape

表2 PPI中的核心基因Table 2 Core genes in PPI

2.5 GO功能富集分析与KEGG通路富集分析

使用R软件37个共同靶点进行GO功能富集分析，其中生物学过程1421条，分子功能63条，细胞组成36条，筛选出排名前20的分子功能，其中预测靶点在生物过程中抗氧化反应(response to oxidative stress)、对金属离子的反应(response to metal ion)、对活性氧的反应(response to reactive oxygen species)列前三位；在细胞组分中细胞膜膜筏(membrane raft)、膜微区(membrane microdomain)、膜区(membrane region)比例最大；而在分子功能中磷酸酶结合(phosphatase binding)和BH域连接(BH domain binding)关系最密切,具体结果见图3～5。图中左侧纵坐标为GO名称，横坐标为富集基因数，颜色代表P值，颜色越红，富集的程度越高，相应的P值越小。

图3 GO通路富集分析的BP分析气泡图(前20)Fig.3 BP analysis of GO pathway enrichment analysis by bubble diagram (top 20)

图4 GO通路富集分析的CC分析气泡图(前20)Fig.4 CC analysis of GO pathway enrichment analysis by bubble diagram (top 20)

图5 GO通路富集分析的MF分析气泡图(前20)Fig.5 MF analysis of GO pathway enrichment analysis by bubble diagram(top 20)

通过KEGG分析结果显示共有41条KEGG代谢通路参与其中,筛选出排名前20条通路,见图6。图中左侧纵坐标为pathway名称，横坐标为富集基因比例，圆圈越大，所富集基因比例越大，P值代表富集的显著性，颜色越红，富集的程度越高。主要涉及PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、细胞凋亡(apoptosis)、内分泌阻力(endocrine resistance)、MAPK 信号通路(MAPK signaling pathway)、Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)、破骨细胞分化(osteoclast differentiation)、NOD样受体信号通路(NOD-like receptor signaling pathway)、RAS信号通路(Ras signaling pathway)等。提示黄芪六君子汤通过调节多种代谢通路共同发挥治疗新冠肺炎的作用。

图6 KEGG通路富集分析气泡图(前20) Fig.6 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis(top 20)

2.6 靶点-作用通路网络构建

将靶点-通路关系文件导入Cytoscape 3.7.2软件, 37个靶点可富集到41条信号通路中,选取排名前20的KEGG代谢通路，构建黄芪六君子汤治疗新冠肺炎靶点-作用通路网络,见图7，图中黄色代表基因，红色代表通路，图形越大，说明该节点度值越大。其中MAPK1/8/3/14，IL6/1β，BCL2/L1，RELA，FOS，EGFR等在各通路中富集次数比较多，见表3。

图7 靶点-信号通路网络Fig.7 Target-pathway network

表3 KEGG通路分析结果(前20)Table 3 KEGG pathway analysis results (top 20)

3 讨论

黄芪六君子汤具有健脾益肺，燥湿化痰之功，主治新型冠状病毒恢复期肺脾气虚证，旨在避免患者瘥后复发。正如叶天士所言“恐炉烟虽熄，灰中有火也”，在新冠肺炎恢复期多以肺脾气虚为主，正虚邪恋。《内外伤辨惑论·饮食劳倦论》有言“脾胃一虚，肺气先绝”，脾胃为后天之本，脾为肺之母脏，脾气健旺则气血生化有源，腠理致密，肺不得侵。黄芪六君子汤中以人参大补元气，复脉生津，黄芪补肺固表，两药合用为君而大补肺脾之气，使正气得复；法半夏、陈皮燥湿化痰，炒白术、茯苓健脾除湿，四药为臣使邪有出路；紫苏梗、桔梗合为佐药以开宣肺气，引药力上达肺络；甘草调和诸药，亦可健脾祛痰。全方补而不滞，共奏肺脾同治，补土生金，祛邪扶正之功。

通过网络药理学研究发现，黄芪六君子汤的活性成分145个化合物，可在体内作用于1618个靶点，根据相互作用靶点数，排名前6的依次是木犀草素、山柰酚、川皮苷、柚皮素、黄芩素、金合欢素，6个化合物均属于黄酮类化合物，黄酮类化合物具有广泛的生物学作用，在抗黄嘌呤氧化酶活性、免疫调节[8]等方面均具有显著效果。研究表明，黄酮类化合物能够通过抑制NOX4/NFkB/MLCK途径减轻甲型流感病毒诱导的屏障功能障碍，可能是防治肺内皮屏障功能障碍和甲型流感病毒的潜在药物[9]。木犀草素常用于消炎止咳、祛痰平喘等，能显著抑制流感病毒的增殖和炎性细胞因子表达，影响凋亡相关因子和通路的表达[10]，具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗肝纤维化等作用[11]。山奈酚具有抗炎、抗氧化、抗病毒、增强机体免疫等多种药理作用[12]。川皮苷、柚皮素具有抗氧化、抗凋亡、抗纤维化、抗炎、抗癌、抗病毒等作用[13-14]。金合欢素具有抗氧化、抗炎抑菌、免疫调节等作用[15]。黄芩素具有抗氧化、抗病毒等多种药理活性，还可抑制病毒细胞的增殖，阻止艾滋病病毒复制、改善甲型流感病毒诱导的急性肺损伤[16]。以上核心成分协同参与免疫调节、抗病毒、抗炎、改善肺损伤及抗纤维化等功能，可能作为黄芪六君子汤治疗新冠肺炎的主要药效群。血管紧张素转化酶Ⅱ(ACE2)是SARS-CoV细胞侵入人体并进行病毒复制所必须的关键环节[17]，当前已有学者将木犀草素、山柰酚、黄芩素与ACE2和新型冠状病毒进行分子对接，以及将川皮苷、柚皮素、金合欢素与新型冠状病毒进行对接后发现[18-22]，这些化合物分子具有同治疗新型冠状病毒肺炎常用药物如瑞德西韦、利巴韦林、利托那韦相近甚至更强的结合力。可见，运用网络药理学预测黄芪六君子汤治疗新冠肺炎的潜在物质基础具有一定的可靠性。

通过PPI网络结果分析，MAPK1/3/8/14，CASP3/8，IL6/1β，ALB，BCL2L1，PTGS2，FOS，RELA是黄芪六君子汤治疗新冠肺炎的主要蛋白，而MAPK1，MAPK3，MAPK8和MAPK14都属于丝裂原活化蛋白激酶家族，在渗透压改变、氧化应激、炎性因子和病毒感染等内环境改变时可被刺激磷酸化而激活[23]，故在PPI网络中与其他基因关系较为密切。CASP3和CASP8是半胱氨酸蛋白酶家族成员，是凋亡机制的关键因子，启动子CASP8可以作用于CASP3的天冬氨酶，使得CASP3作用于特定细胞底物的关键裂解，最终导致细胞凋亡[24]。IL6，IL1β同属白介素家族，是重要的炎症因子，共同作用参与炎症的病理过程。BCL2L1是Bcl-2蛋白家族的一员，在细胞凋亡中起关键作用，许多抗癌药物通过靶向Bcl-2家族蛋白诱导细胞凋亡[25]。FOS是原癌基因，可参与各效应酶信号传递系统的转录过程,调控其他多种基因的靶蛋白合成,从而影响细胞的增殖和分化[26]。RELA是NFκB家族成员之一，参与调控抗中性粒细胞凋亡，通过调控KLF-2抑制促炎因子的表达、内皮细胞的活化以及炎症细胞、黏附等抗炎作用对肺组织炎症产生影响[27]。结合GO功能结果分析可知，黄芪六君子汤治疗新冠肺炎的靶点主要通过炎症反应、细胞凋亡、氧化还原、免疫应答等过程对疾病产生治疗作用。

在KEGG通路富集结果中显示，黄芪六君子汤治疗新冠肺炎的核心靶点主要涉及PI3K-Akt信号通路、细胞凋亡、内分泌阻力、MAPK 信号通路、Toll样受体信号通路、破骨细胞分化、NOD样受体信号通路、RAS信号通路等，富集在炎症相关通路所占比例较多，提示黄芪六君子汤可能作用于多种细胞因子而抑制细胞因子风暴。有研究证明，PI3K-Akt信号通路在SARS-CoV和MERS-CoV的感染过程中起到重要作用，并可能作为抵御冠状病毒的药物靶标[28]。MAPK，RAS等信号通路与肺癌、肺纤维化以及气道炎症等肺部疾病密切相关[29-31]，Toll样受体被认为是抵御入侵微生物的第一道防线，可诱发NFκB信号通路活动，进一步诱发IL1β等相关基因表达，同时可调节免疫反应中涉及的多种基因的表达[32]，Totura等[33]研究表明，Toll样受体缺失的小鼠比野生型小鼠更易感染SARS-CoV，NOD样受体作为先天性免疫应答的一部分，参与抗细菌、病毒免疫应答[34]。

综上所述，基于网络药理学的研究方法，可得出黄芪六君子汤主要通过抗病毒、抗炎、免疫调节等作用机制对新冠肺炎发挥治疗作用。但由于网络药理学的局限性以及目前对新型冠状病毒致病机制的认识不足，研究结果还存在一定的偏差，需在实验及临床中进一步验证。