灸疗对失眠大鼠脑组织γ-氨基丁酸转运体表达及组穴配伍研究

乎宝力格，澈力木格，高玉峰

(内蒙古民族大学附属医院，内蒙古 通辽 028007)

失眠不仅仅是老年人的常见症状，而且越来越年轻化，严重影响人们的健康。这与社会竞争压力的日益加剧及人际关系的复杂化有关，是当今医学领域的研究重点。

蒙医灸疗法(拖呐胡扎萨拉)为蒙医传统疗法之一，是将艾草条或艾草柱烧灼后在人体特定穴位或病变部位，直接或间接地给予温热感而达到预防或治疗目的。《素问·异法方易论》中有“北方者，天地所闭藏之域也。其地高陵居，风寒冰冽，其民乐野处而乳食，藏寒生满病，其治宜灸，故灸焫者，亦从北方来”的记载。

灸疗法疗效奇特、无毒副作用、简便易操作，在治疗失眠、焦虑、抑郁方面有独特的优势。蒙医学中赫依三穴指的是顶会穴(敖瑞音博乐其日)、赫依穴(赫依音博乐其日)、黑白际穴(哈日查干乃博乐其日)。赫依穴(赫依音博乐其日)位于颈椎第七棘突与胸椎第一棘突间隙窝中，主治：心悸、夜不安寐、白昼嗜眠、耳聋、耳鸣、头晕头痛、颈项强直等症；顶会穴(敖瑞音博乐其日)位于两耳角连线中点，即头顶正中心，主治：赫依性音哑症、巴达干性视力减退、神志不清、癫狂、头晕头痛等症；黑白际穴(哈日查干乃博乐其日)位于两乳正中的心窝处，主治：心悸、心前区不适、夜不安寐等症。

在前期研究[1-7]中发现施灸赫依三穴可改善模型大鼠睡眠，调节下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴相关调节因子5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)等神经递质及白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)等细胞因子。

据研究[8]，γ-氨基丁酸转运体(GAT)也是HPA轴重要的调节因子。GAT不仅参与对HPA轴的调节，同时也直接参与了对睡眠的调节。

GAT[9]是一种糖蛋白，位于神经元及胶质膜上，GAT在脑组织内的作用是摄取突触间隙及细胞外液的γ-氨基丁酸，从而终止γ-氨基丁酸的抑制作用，即终止或控制睡眠障碍、焦虑抑郁及精神错乱等神经系统性疾病的发生或发展。相反，GAT表达异常会导致γ-氨基丁酸神经信号传递，从而导致各种神经系统疾病的发生。GAT分为4种，即GAT-1、GAT-2、GAT-3、GAT-4，其中GAT-1是最主要的神经元转运蛋白，GAT-1的动态变化在一定程度上代表了GABA能神经元的变化。

本实验拟用蒙医灸疗取有效腧穴——赫依三穴，作用于失眠模型大鼠，观察模型大鼠行为学变化，运用PCR方法，观察大鼠脑干组织GAT-1的表达及二三穴组穴配伍后GAT-1的表达变化，探究灸疗在失眠治疗中的可能作用机制及组穴配伍后的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

100只SD实验大鼠，体重(200±5)g，购自沈阳市实验动物中心，合格证-SXSK(辽)2015-0001。

1.2 试剂及仪器

对氯苯丙氨酸(PCPA)由北京环亚太克生物医学技术有限公司提供，TRNzol总RNA提取试剂由天根生化科技(北京)有限公司提供，艾灸贴购自苏州东方艾绒厂，AUW120D型岛津电子天平(日本岛津)，QL-902型涡旋振荡仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，Tanon 1600型凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)，ABI7500型荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)。

2 方法

2.1 模型建立

本实验采用PCPA造模法[9]，将PCPA用生理盐水配置成混悬液(45 mg/100 g)。除正常组，其他组腹腔注射PCPA混悬液(1 mg/100 g)，每天8∶00注射1次，连续注射2天。第一次注射24 h后大鼠已开始走动举肢频繁、对外界刺激敏感、昼伏夜出节律消失等睡眠障碍症状。

2.2 选穴依据与原则

选穴：依据《中国医学百科全书(蒙医学)》[10]及《蒙医实验疗术学》[11]取有效腧穴——赫依三穴，即顶会穴、赫依穴、黑白际穴。

2.3 分组及干预方法

将100只SD大鼠随机分为10组，即正常对照组、模型组、安定组(阳性对照组)、单穴组(顶会穴组、赫依穴组、黑白际穴组)，二三穴组(顶会穴与赫依穴组、顶会穴与黑白际穴组、赫依穴与黑白际穴组、三穴组)，每组10只。 正常组：腹腔注射0.9%氯化钠溶液(1 mL/100 g)，每日1次，连续2日注射；第三天开始每天抓取、固定1次，不做其他处理，连续7天。模型组：第三天开始每天抓取、固定1次，不做其他处理，连续7天。安定组：第三天开始，每日1次灌胃安定(地西泮)注射液，0.92 mg/kg，连续7天。顶会穴组：第三天开始，施灸大鼠“顶会穴”，每日1次，每次施灸5 min(约三个艾灸贴)，连续7天。赫依穴组：第三天开始，施灸大鼠“赫依穴”，每日1次，每次5 min，连续7天。黑白际穴组：第三天开始，施灸大鼠“黑白际穴”，每日1次，每次5 min，连续7天。顶会穴与赫依穴组：第三天开始，同时施灸顶会穴与赫依穴，每日施灸1次，每次5 min，连续7天。顶会穴与黑白际穴组：第三天开始，同时施灸顶会穴与黑白际穴，每日施灸1次，每次5 min，连续7天。赫依穴与黑白际穴组：第三天开始，同时施灸赫依穴与黑白际穴，每日施灸1次，每次5 min，连续7天。三穴组：第三天开始，同时施灸顶会穴、赫依穴与黑白际穴，每日施灸1次，每次5 min，连续7天。

2.4 观察指标及检测方法

取大鼠脑干组织，放入液氮罐中冷冻，再存储于-80 ℃冰箱中备用。选取GAT-1引物序列；脑组织置入1 mLTrizol中加入0.2 mL氯仿，室温孵育10 min，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，取上层液，加入等体积异丙醇，混匀，室温孵育10 min，4 ℃12 000 r/min离心10 min，沉淀物通过DEPC水洗涤后，提取出脑组织总RNA。将RNA转录成cDNA，PCR扩增，产物用凝胶成像系统观察结果、照相，用半定量分析凝胶成像系统软件测定各电泳带光密度值。

2.5 统计方法

2.6 统计分析

2.6.1 蒙医灸疗法对SD大鼠脑组织中GAT-1的影响 ①与正常组相比，模型组脑干GAT-1含量降低，差异有显著性(P<0.05)；②与模型组相比，安定组及各治疗组GAT-1含量更降低，差异有显著性(P<0.05)。见表1、图1。

表1 蒙医灸疗法对SD大鼠脑组织中GAT-1的影响

注：图中数字1代表正常组，数字2代表模型组，数字3代表安定组，数字4代表赫依组，数字5代表顶会，数字6代表黑白际组GAT-1含量。

2.6.2 二三穴组穴配伍后蒙医灸疗对模型大鼠脑干组织中GAT-1含量的影响 与模型组相比，各治疗组GAT-1含量更降低，差异有显著性(P<0.05)。见表2、图2。

表2 组穴配伍后蒙医灸疗法对模型大鼠脑干组织中GAT-1的影响

注：图中数字1、2代表正常组，数字3、4代表模型组，数字5、6代表安定组，数字7、8代表赫依顶会组，数字9、10代表黑白际顶会穴组，数字11、12代表赫依黑白际穴组，数字13、14代表三穴组GAT-1含量。

3 讨论

蒙医学中三根(赫依、希拉、巴达干)是生命活动的三种能量和基本物质，三根互相制约，互相依存，保持机体的平衡。三根失去平衡是引起疾病最根本的原因，其中赫依既是一切疾病的前导，也是一切疾病的末尾[10-12]。人体在饮食(过量进食味苦、性轻食物)、起居(起居阴凉)、气候(长期冷风吹袭)、其他(惊吓)等四个发病条件的作用下，赫依偏胜，三根失去平衡，气血紊乱累及心脏与白脉，从而引起失眠，因此，大多属赫依病范畴。而蒙医灸疗法则是镇赫依之邪，抑制赫依病扩散、醒脑开窍之良方[13]。蒙医学经典著作《甘露四部》[14]中记载：“赫依增多则出现身体黑瘦、喜暖、头晕、失眠，体力衰弱……”“赫依偏盛引起的疾病以敖瑞音博乐其日、赫依音博乐其日、哈日查干乃博乐其日灸之……”。 临床中，在顶会穴、赫依穴、黑白际穴等穴位上施灸，可治疗心烦易怒、心悸、失眠等各种赫依性病症。而且施灸单穴或施灸二三穴配伍治疗均具有抗失眠的疗效。

γ-氨基丁酸(GABA)是一种抑制性神经递质，存在于哺乳动物枢神经系统中[15-16]。GABA神经元兴奋时，GABA被神经末梢释放到突触间隙，并通过与位于突触后膜的GABA受体结合发挥作用。终止递质的作用主要依赖位于突触前膜和胶质细胞膜的GAT对突触间隙内的GABA的摄取功能。GAT对已释放的GABA的摄取作用能有效控制突触间隙GABA浓度及潴留时间，从而调控GABA神经信号传导，防止神经细胞过于兴奋，调理睡眠。

据研究[8-9]，中枢神经系统性疾病，如睡眠障碍、焦虑、抑郁及各种轻中重度疼痛都与 GABA的抑制性突触传递作用有密切关系，调节转运体蛋白功能，可作为治疗中枢神经系统疾病的新方法。研究证明GAT-1是最主要的神经元转运蛋白，GAT-1的动态变化在一定程度上代表了GABA能神经元的变化，在实验中可作为观察指标。

该实验中，大鼠腹腔注射PCPA后 24 h开始出现走动次数明显，举肢、不能安卧等外部特征。安定组与各灸疗组开始干预后大鼠精神状态好转，整体观察与模型组不同，GAT-1的表达也较模型组下降，表示安定组与灸疗组改善了实验动物的失眠症状。推测赫依三穴在单穴治疗和组穴配伍后的治疗中，对PCR法检测的GAT-1的表达有着共同的降低调节作用。从RNA水平证实了蒙医灸疗镇静催眠作用机制，证实了施灸赫依三穴在单穴治疗和组穴配伍治疗中均有镇静催眠作用。