γ 射线辐照结合球磨处理灵芝孢子粉破壁新工艺研究

齐 慧 陈 亮 武小芬 张 勇 邓 明 王克勤

（湖南省农业科学院 湖南省核农学与航天育种研究所 长沙410125）

灵芝（Ganoderma lucidum）为多孔菌科灵芝属药食两用真菌。灵芝孢子是灵芝子实体发育成熟后释放出来的种子，是灵芝的生殖细胞。灵芝孢子中含有丰富的多糖、萜类、有机锗等多种活性成分，常被作为保健食品或药品［1-2］用于延缓衰老，调节免疫甚至抗辐射［3-4］。灵芝孢子极其细微，呈卵形双壁结构，最外层为几丁质纤维素，能够阻碍人体消化吸收，因此需要对灵芝孢子进行破壁处理，促进活性功能成分的释放，提升其食用及药用价值［5-7］。

破壁效果直接影响破壁率，也决定了人体对灵芝孢子内有效成分的吸收率，因此选择好的破壁方式显得尤为重要。传统采用的破壁方法主要有物理法、机械法、生物法、化学法、综合法等。（1）物理法包括低温、冷冻脆化、超声、微波［8-9］等，此类方法的破坏能力有限，无法满足破壁率高的要求；另外CO2超临界破壁虽然破壁率高，但是灵芝孢子粉的有效成分会因瞬间高压释放到大气中而丧失［10-11］。（2）机械法包括高能纳米冲击磨法、超高压超级临界流体撞击流法、高压脉冲电场处理技术法、机械研磨法、均质法等，诸多机械方法虽能大大提高破壁率，但由于对设备要求高，目前大多停留在实验室阶段，难以用于大规模生产［12］。相比较而言，机械研磨法、均质法较为简便易行［13］。（3）生物法多采用酶法处理，此法具有针对性强，效果优越等特点，但是作用时间较长，去除产品中加入的酶较困难，加之酶的价格昂贵，造成处理成本高，因此不适合大规模生产［14］。（4）化学法采用化学试剂浸泡处理。由于具有化学成分掺入、残留物质处理不完全且耗时耗力等缺点，较少应用于生产［15-16］。（5）综合法主要包括机械法与物理法联合、物理法与生物法联合、机械法与化学法联合3大类，综合法可以克服单一破壁方法的缺点，但工序较为繁琐［17-18］。因此，亟需探求新的、低能高效、环保的破壁方法。

辐照能破坏纤维素的内部结构，达到降解目的［19-20］。辐照具有杀菌效果，且当吸收剂量超过一定范围时，会影响灵芝孢子粉的灵芝多糖含量［21］。球磨处理属于机械粉碎的一种，常用来作为制备纳米级材料的一种手段，具有粉碎能力强劲、产物粒径均匀等优点［22-23］。到目前为止，关于γ射线辐照结合球磨处理灵芝孢子粉的相关报道较少，γ射线辐照结合球磨处理对灵芝孢子粉破壁率及灵芝多糖含量是否有影响需要进一步探讨。本文将以破壁率和灵芝多糖含量为指标，结合灵芝孢子的微观结构，对比γ 射线辐照处理、球磨处理、γ射线辐照联合球磨处理对灵芝孢子粉破壁的效果，旨在为灵芝孢子粉破壁利用提供技术支撑和理论基础。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

灵芝孢子粉由湖南省宜章县福城生物科技开发有限公司提供，水分含量约12%。

无水乙醇、苯酚、七水合硫酸锌、葡萄糖（均为分析纯）、石油醚、冰乙酸、三氯甲烷、可溶性淀粉、无水硫酸钠：国药集团化学试剂有限公司；浓硫酸（分析纯）：成都市科隆化学品有限公司；硫代硫酸钠标准溶液（0.01 mol/L）：深圳市博林达科技有限公司；碘化钾：广东光华科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

60Co γ 辐照装置：湖南省核农学与航天育种研究所；DZ400/2D 真空包装机：温州市鹿城区黄龙华机械厂；Eco-S15纯水机：上海和泰仪器有限公司；KQ5200DE型数控超声清洗器：昆山市超声仪器有限公司；XQM-4 球磨粉碎机；& KL-1 空冷机：长沙天创粉末技术有限公司；真空干燥器300G 型：日本Asone；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；万能高能粉碎机DE-100g：浙江红景天工贸有限公司；XSP-10CA显微镜：上海佑科仪器仪表有限公司；Nicolet iS5傅里叶变换红外（FTIR）光谱仪：美国赛默飞世尔科技公司；JSM-6380LV 扫描电子显微镜（SEM）光谱仪：日本电子株式会社；BlueStar A紫外分光光度计：北京莱伯泰科仪器股份有限公司；TG16-WS离心机：湖南迈克尔实验仪器科技有限公司；XH-C涡旋混合器：江苏金怡仪器科技有限公司；GZX-6246 MBE 电热恒温鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司；FA 2004 C 电子天平：上海佑科仪器仪表有限公司；DL-1 万用电炉：北京市永光明医疗仪器有限公司；RE-2000B 旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂。

1.3 处理及测定方法

1.3.1 灵芝孢子粉γ射线辐照处理

灵芝孢子粉装入包装袋内，真空包装机抽真空并封口后，于室温下用60Co γ射线进行动态辐照处理，剂量率1.25 kGy/h，吸收剂量设定为0 kGy、5 kGy、10 kGy、15 kGy、20 kGy，实际吸收剂量分别为0 kGy、4.892 kGy、9.957 kGy、15.231 kGy、19.913 kGy（采用重铬酸银剂量计跟踪检测），备用。

1.3.2 灵芝孢子粉球磨处理

取辐照后的灵芝孢子粉10 g 置于球磨粉碎机中（每次粉碎前，将球磨罐体内的残留物、钢珠等清洗干净，60 ℃烘干后再使用），空冷机设置温度10 ℃，待达到设定温度，启动球磨仪开关，待达到设定转速时开始计时。取球磨处理1 min、2 min、5 min、10 min的样品，备用。

1.3.3 灵芝多糖提取及测定

采用苯酚-硫酸法测定灵芝多糖含量。准确称取经不同处理方式处理后的灵芝孢子粉（经不同吸收剂量的辐照处理结合不同时间的球磨处理，其中吸收剂量分别为0 kGy、4.892 kGy、9.957 kGy、15.231 kGy、19.913 kGy，球磨处理时间分别为1 min、2 min、5 min、10 min，共25种组合处理方式，共25个样品）1.0 g置于50 mL容量瓶中，加入12 mL双重蒸馏水，浸泡24 h，超声波加热提取60 min，取出，放冷，用双重蒸馏水定容至50 mL，摇匀后过滤，弃去初滤液，吸取滤液10 mL，加入40 mL无水乙醇，混匀，3 000 r/min离心10 min，弃上清液，残渣用80%乙醇洗涤，离心（重复此过程2次），剩余残渣用2 mol/L硫酸10 mL溶解后加水定容至25 mL。

每组3次平行试验，吸取1 mL上述溶液于20 mL比色管中，加水至2 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，浓硫酸10 mL，沸水浴放置2 min 冷却至室温，在489 nm 波长处测定吸光度值。依据标准曲线计算多糖含量（葡萄糖对照）。

1.3.4 灵芝孢子粉破壁率测定[24]

参照标准《NY/T 1677―2008 破壁灵芝孢子粉破壁率的测定》。孢子粉预处理：孢子粉置于0.15 mm筛上，100 mL超纯水冲洗，500 mL锥形瓶收集孢子粉悬浮液。定性滤纸过滤，滤渣60 ℃烘干至恒重，备用。

孢子计数及标准曲线绘制：分别精确称取0.010 g、0.020 g、0.030 g、0.040 g、0.050 g（精确至0.001 g）于25 mL 容量瓶中，加入孢子粉悬浮液（v70g/L硫酸锌溶液∶v无水乙醇=10∶1现配现用）10 mL，涡旋振荡，使结块孢子粉散开。再超声处理1 h，每隔15 min摇匀一次，再用悬浮液定容至25 mL。再采用血球计数板（25中格×16小格）在光学显微镜400倍放大率下依次对该系列悬浮液中的灵芝孢子进行计数，按对角线法取4个角和最中间共5个中格为1个计数单位，每个样品观察计数时应去掉离群较大的值，观察计数不少于6次，然后取其平均值。最后以灵芝孢子粉称样量为横坐标，以每个计数单位孢子平均数为纵坐标，用Excel 2010回归做标准曲线。

试验样品准确称量0.040 g，按以上步骤进行孢子粉计数试验，每组试验3 个平行，结果取平均值。

1.3.5 过氧化值测定

参照标准《GB 5009.227―2016 食品安全国家标准食品中过氧化值的测定》。

孢子粉预处理：孢子粉样品置于广口瓶中，加入2～3倍体积的石油醚，摇匀，充分混合后静置浸提12 h 以上，经装有无水硫酸钠的漏斗过滤，取滤液，在低于40 ℃的水浴中，用旋转蒸发仪加压蒸干石油醚，残留物即为待测试样。

试样的测定：应避免在阳光直射下进行试样测定。称取待测试样2.000 g（精确至0.001 g）置于250 mL碘量瓶中，加入30 mL三氯甲烷-冰乙酸混合液，轻轻振摇使试样完全溶解。准确加入1 mL饱和碘化钾溶液，塞紧瓶塞，并轻轻振摇0.5 min，在暗处放置3 min。取出，加入100 mL水，摇匀后立即用硫代硫酸钠标准溶液滴定析出的碘，滴定至淡黄色，加1 mL 淀粉指示剂，继续滴定并强烈振摇至蓝色消失为终点。同时进行空白试验。

1.3.6 SEM分析测定

将经过不同处理（0 kGy、15.231 kGy 辐照处理；0 kGy、15.231 kGy辐照处理结合5 min球磨处理）后的灵芝孢子粉于65 ℃下烘干，将干燥后的样品采用导电的双面胶带粘在样品台上，然后将样品放于真空罩内，在真空状态下喷镀一层金属导电膜后进行扫描电子显微镜观察，检测电压为20 kV。

1.3.7 FTIR光谱分析

将不同处理后（0 kGy、15.231 kGy辐照处理；0 kGy、15.231 kGy 辐照处理结合5 min 球磨处理）的灵芝孢子粉于65 ℃下烘干，取适量粉末样品与KBr 研磨均匀后压片，在4 000～500 cm-1区间进行红外扫描分析。

1.3.8 数据分析

数据统计分析用SAS 和Microsoft Excel 2010，多图线绘制用Origin 8.0（图2）软件。

2 结果与分析

2.1 球磨结合γ射线辐照对灵芝孢子粉破壁率的影响

表1 列出了γ 射线辐照不同剂量结合不同时间的球磨处理后的灵芝孢子粉的破壁率。由表1 可知，单一辐照处理条件下，吸收剂量在0～19.913 kGy范围内，灵芝孢子粉破壁率随着吸收剂量的增大逐渐增大，但增长速率不明显，吸收剂量19.913 kGy孢子粉，其破壁率较吸收剂量4.892 kGy 的孢子粉增加40.64%。单一球磨处理条件下，球磨时间0～10 min范围内，随着球磨时间的增加，灵芝孢子粉破壁率增加明显，10 min球磨处理后的灵芝孢子粉其破壁率较1 min球磨处理的孢子粉增加982.18%。当吸收剂量为15.231 kGy，球磨处理5 min后的灵芝孢子粉，其破壁率达到97.18%，较单一吸收剂量15.231 kGy 孢子粉的破壁率增长1 365.84%，较单一球磨处理5 min 孢子粉的破壁率增长96.97%，说明辐照处理与球磨处理对灵芝孢子粉破壁率具有协同作用，两者协同处理破壁率有较大的提升，原因可能是辐照能量作用于孢子粉外壁几丁质纤维素结构，由于能量限制无法直接造成破壁，但是能量的聚集使得后续球磨破壁的效果更大程度地显现，使得破壁率显著性提升。继续增大吸收剂量或球磨时间，均对灵芝孢子粉破壁率的影响不显著。有研究表明辐照能破坏物质的内部结构，使得粉碎能耗大幅度降低［25］。由表1可知，在达到相同破壁率的情况下，选择辐照结合球磨处理，可以减少球磨时间，如球磨处理10 min，破壁率达82.57%，而吸收剂量9.957 kGy结合球磨5 min，破壁率即可达到81.68%。

表1 γ射线辐照结合球磨处理对灵芝孢子粉破壁率的影响Table 1 Effects of γ ray irradiation collaborated with ball milling on the wall-broken rate ofGanoderma lucidum spore powders

表2为灵芝孢子粉破壁率的双因素方差试验结果，通过查询F-分布表，F0.01（4，50）=3.720，F0.01（16，50）=2.380，表明吸收剂量、球磨时间均对灵芝孢子粉破壁率有极显著性影响，且两者存在交互作用，交互作用对灵芝孢子粉破壁率也有极显著性影响，其中球磨的贡献率最大。

表2 灵芝孢子粉破壁率双因素方差分析表Table 2 Two factors(absorbed dose and the time of milling)variance analysis of the wall-broken rates of Ganoderma lucidum spore powders

2.2 球磨结合γ射线辐照对灵芝孢子粉灵芝多糖含量的影响

表3 列出了γ 射线辐照不同剂量结合不同时间的球磨处理后的灵芝孢子粉经提取、测定所得的多糖含量。陈志军等［21］研究发现γ 射线辐照处理对灵芝多糖含量的增加有一定的促进作用，且剂量超过一定范围时，会对多糖含量产生显著性影响，与本试验结果一致。由表3可知，单一辐照处理条件下，当吸收剂量0～19.913 kGy 范围内，随着吸收剂量的增加，孢子粉灵芝多糖含量有一定增加，吸收剂量为19.913 kGy 孢子粉灵芝多糖含量较未辐照样品增加19.32%。原因可能是辐照对灵芝孢子粉的外壁几丁质纤维素结构有一定的破坏作用，使得孢内物质更好地释放出来，从而灵芝多糖含量有所增加。在单一球磨处理条件下，当球磨时间在0～5 min范围内，随着球磨时间的增加，灵芝多糖的含量有明显地提高，当球磨时间进一步增加，对多糖含量的影响不显著，且球磨时间过长，造成腔体发热，影响灵芝孢子粉的色泽和品质。原因可能是随着球磨时间的增加，球磨作用充分，灵芝孢子粉破壁率提升，使得更多的孢内物质释放，从而多糖含量增加。当辐照结合球磨处理灵芝孢子粉时，灵芝多糖含量变化显著。试验范围内，灵芝多糖的最大值在灵芝孢子粉吸收剂量15.231 kGy 结合球磨处理5 min 后得到，其多糖含量达到13.230 mg/g，较未进行任何处理的灵芝孢子粉，多糖含量增加了139.50%；较单一辐照处理且吸收剂量为15.231 kGy 孢子粉，多糖含量增加了103.88%；较单一球磨处理5 min孢子粉，多糖含量增加了53.62%，说明辐照与球磨具有协同效应，大大提升了灵芝多糖的含量。

表3 γ射线辐照结合球磨处理对灵芝孢子粉灵芝多糖的影响Table 3 Effects of γ ray irradiation collaborated with ball milling on the polysaccharide contents of Ganoderma lucidum spore powders (mg/g)

表4 列出了γ 射线辐照不同剂量结合不同时间的球磨处理后的灵芝孢子粉中的过氧化值含量。在0～19.913 kGy范围内γ射线辐照处理，对灵芝孢子粉过氧化值的影响不大，均小于0.01%。在0～10 min 范围内的球磨处理，随着球磨时间的增加，对灵芝孢子粉过氧化值变化显著，10 min球磨处理样品较1 min 球磨处理样品，过氧化值增加了24倍。原因可能是球磨过程中产生热量，导致孢子油等物质氧化，过氧化值增加。辐照协同球磨处理会加速油脂氧化，超过一定量后会形成蛤味，影响产品的品质［26］。试验过程中，连续球磨处理10 min 的孢子粉，过氧化值较高，有一定的蛤味，且随着辐照剂量的增大而加重。磨时间均对灵芝孢子粉破壁率有极显著性影响，且两者存在交互左右，交互作用对灵芝孢子粉破壁率也有极显著性影响，其中球磨的贡献率最大。

表4 γ射线辐照结合球磨处理对灵芝孢子粉过氧化值的影响Table 4 Effects of γ ray irradiation collaborated with ball milling on the peroxide value of ganoderma spore powders(%)

2.3 球磨结合γ射线辐照对灵芝孢子粉外观形态的影响

由图1（a），未经过任何处理的灵芝孢子，其孢子外壁保存完好，呈椭圆形卵状结构，且表面有诸多均匀分布的小孔，有个别破碎现象，这可能是在灵芝孢子粉收集过程中造成的自然现象。对比图1（a）和（b），球磨处理5 min后，许多灵芝孢子的完整结构被破坏，能较清晰地看到内孢壁和外孢壁，表层小孔多被覆盖，出现较多的碎片结构，说明球磨处理能提升灵芝孢子粉破壁率，破坏孢子孢壁结构。

图1 不同处理条件下灵芝孢子粉扫描电镜图谱：(a)0 kGy;(b)0 kGy,球磨5 min;(c)15.231 kGy;(d)15.231 kGy,球磨5 minFig.1 Pictures of Ganoderma lucidum spore powders by electron microscope with four different treatments:(a)0 kGy;(b)0 kGy,ball milling for 5 min;(c)15.231 kGy;(d)15.231 kGy,ball milling for 5 min

对比图1（a）和（c），15.231 kGy辐照处理灵芝孢子较未处理样品，扫描电镜图显示结构相差不大，孢子粉结构均较完整，呈椭圆形卵状结构，顶端呈断面结构，且孢子表面有许多小孔结构［27］。对比图1（c）和（d），当γ射线辐照结合球磨处理灵芝孢子粉，孢子的完整结构几乎完全消失，碎片较单一球磨处理的样品也更多更细，说明破碎更彻底。扫描电镜试验结果进一步证明辐照处理与球磨处理之间具有协同效应。

2.4 球磨结合辐照γ射线处理对灵芝孢子分子结构的影响

不同处理条件下灵芝孢子粉红外光谱见图2。

图2 不同处理条件下灵芝孢子粉红外光谱图：A,0 kGy;B,15.231 kGy;C,0 kGy,球磨5min;D,15.231kGy,球磨5minFig.2 FTIRspectraof Ganoderma lucidumspore powders with four differenttreatments:A,0kGy;B,15.231 kGy;C,0 kGy,ball milling for 5 min;D,15.231 kGy,ball milling for 5 min

对比图2中线条A和D，说明破壁与未破壁灵芝孢子在峰型、峰数、峰位有较高程度的一致性。2 923 cm-1、2 853 cm-1处出现的较强尖峰，是甲基-CH3和亚甲基-CH2的C-H 伸 缩 振 动 吸 收 峰［27］；1 746 cm-1附近的有强吸收峰，是脂肪酸中C=O伸缩振动，峰强度越高说明脂肪酸含量高，破壁率高的样品，此处峰强度高，说明破壁使得更多的孢子油释放；1 652 cm-1为糖醛酸的伸缩振动吸收峰［28］，峰强度越高，说明多糖含量高，与2.2节研究结果相一致；1 076 cm-1、1 038 cm-1处是糖环内酯C-O-C 强极性吸收峰，破壁率高的样品，此处峰强度相对高。破壁率较高的灵芝孢子样品在1 456 cm-1处出现了小尖峰，在1 652 cm-1处，出现双峰，与刘有菊等［29］研究结果一致，破壁率不同的样品，在此处有较明显差异，说明破壁前后化学成分上有差异。因此，可以尝试通过红外光谱的测定结果，科学地快速以甄别市场上良莠不齐的破壁孢子粉产品［30-31］。

表6为不同处理条件下部分峰强度比率。

表6 不同处理条件下部分峰强度比率Table 6 Mean Ratios of absorption peak intensity at four different treatments

由表6，4 种不同处理在A1635/A1746、A1076/A1635、A1076/A1746的峰强度比率上具有一定的规律性。对比在吸收剂量0 kGy、吸收剂量15.231 kGy、球磨5 min、吸收剂量15.231 kGy辐照结合5 min球磨处理条件下的A1635/A1746、A1076/A1635、A1076/A1746的峰强度比率，此几处峰强度比率逐渐增大；而此几种条件下，灵芝孢子粉的破壁率和多糖含量也是逐渐增大的趋势；此结果与Chen等［30］研究一致。因此可以从A1635/A1746、A1076/A1635、A1076/A1746的峰强度比率较直观地了解灵芝孢子粉的破壁情况。

3 结论

在一定吸收剂量范围内的辐照处理和一定球磨时间范围内球磨处理对灵芝孢子粉的破壁率和多糖含量均有显著性的影响，其中球磨处理的影响程度更大；且两种处理方式间存在交互作用，且交互作用对灵芝孢子粉的破壁率和多糖含量的影响均具有显著性，因此两种处理方式协同处理灵芝孢子粉，既能满足破壁率的要求，提高灵芝多糖含量，又能很好地维持灵芝孢子粉的品质。试验最佳工艺参数为：吸收剂量15.231 kGy，结合球磨处理5 min，灵芝孢子粉破壁率达到97.18%；多糖含量达到13.230 mg/g，较未经处理的灵芝孢子粉样品增加了139.50%。另外扫描电镜结果显示，灵芝孢子的完整结构几乎完全消失，破碎十分彻底；红外光谱结果显示在1 456 cm-1出现小尖峰，1 652 cm-1处出现双峰，完全区别于未破壁孢子，进一步验证了辐照处理与球磨处理的协同效应。