重离子辐照对盐生杜氏藻的诱变效应及光合响应机理

席一梅 殷 亮 迟占有 李 欣 罗光宏

1（河西学院 甘肃省微藻技术创新中心 张掖734000）

2（大连理工大学生物工程学院 大连116024）

3（中国科学院近代物理研究所 兰州730000）

重离子束与传统的辐照（如X 射线和γ 射线）相比，具有更高的传能线密度（LET）和相对生物效应（RBE）优势［1-2］。在分子水平上，重离子束辐照可更有效地导致DNA 双链的断裂、大量缺失和插入以及染色体重排［3-4］。重离子辐照突变可获得更高突变率和更广泛的突变类型，目前已被广泛应用于生物医学及植物的品种改良［5-7］。重离子辐照对生物体的诱变机理的研究对进一步科学合理地应用这项技术具有重要的价值，但其研究相对滞后。

微藻是地球上广泛分布的光能自养型微生物，其独特的光合系统和清晰的遗传背景使其成为理想的新一代微生物细胞工厂。盐生杜氏藻（Dunaliella salina）是一种单细胞的嗜盐经济绿藻，种类繁多，分布于海洋和高盐环境中，是β-胡萝卜素的最佳天然生物来源［8］。然而，在正常培养条件下，盐生杜氏藻光合效率和β-胡萝卜素产量较低，严重制约了其大规模的生产和应用。因此，如何高效提升盐生杜氏藻的光合效率和β-胡萝卜素的产量极具研究和应用价值［9］。近年来，重离子束辐照技术在微藻品质改良研究中得到了初步的应用。Taleb 等［10］使用氩离子对单细胞小球藻（Chlorella vulgaris）进行辐照处理，经过多次筛选得到脂质含量比野生型显著提升的突变株。Hu 等［11］通过重离子对沙漠链带藻（Desmodesmus sp. S1）进行辐照诱变，获得了油脂含量提高20.6%的突变藻株D90G-19，而他们通过同样策略筛选获得的一株微拟球藻突变株HP-1（Nannochloropsis oceanica HP-1），其生物量和油脂含量分别提高了19%和28%［11］，同时，筛选出的突变株的D90G-19 和HP-1 光合效率均高于野生株。上述研究表明：重离子辐照对藻类的光合系统具有显著影响，但吸收剂量及时间对光合系统的损伤及修复机制的研究尚不清晰，迄今为止，重离子对微藻细胞光合系统的诱变靶点、以及微藻细胞对辐照诱变的响应机制研究只有很少的报道。例如，在蓝藻中，光系统II（PSII）被证明是γ 辐射对光合复合物精细结构的特定目标［12］。Angelini 等［13］报道了离子辐射会损害植物光系统并减少光合作用的氧气释放；de Micco 等［14］研究表明，离子辐射会影响光合生物光合系统的相关蛋白元件，比如捕光天线复合物、电子传递载体以及碳固定中的酶。盐生杜氏藻是极具应用价值的经济藻种，也是重要的研究逆境生理适应机制的模式绿藻［9］，但重离子束对盐生杜氏藻的辐照研究在国内外尚未见报道。基于上述原因，我们拟选择重离子束对盐生杜氏藻进行辐照处理，以期探究重离子辐照对绿藻的生物学效应以及绿藻细胞对辐照损伤的光合响应机制。

本研究利用中国科学院近代物理研究所重离子加速器（HIRFL）产生的重离子对对数生长期的盐生杜氏藻细胞进行辐照处理，系统探究了重离子辐照对藻细胞的时间和剂量效应，并对藻细胞的光合效率相关指标（光化学效率（Fv/Fm）、实际光合效率（ΦPSII）、热耗散能力（NPQ）以及代谢产物β-胡萝卜素的积累等）进行了测定，为进一步了解重离子辐照对盐生杜氏藻光合系统的诱变机理提供了初步的实验数据和理论依据。

1 材料与方法

1.1 藻种及培养基

盐生杜氏藻（Dunaliella salina CCAP 19/18）购于英国Culture Collection of Algae and Protozoa（Windermere， United Kingdom）公司，藻种在优化的人工海水（ASW）培养基中进行摇瓶培养，培养温度（25±2）℃，光照强度约为50 μmol/(m2·s)，光暗周期为12 h∶12 h 每天定期手动摇3～4次并变换位置。

ASW培养基成份：NaCl 87.75 g/L，KNO30.5 g/L，K2HPO4·3H2O 0.08 g/L，CaCl20.111 g/L，MgCl2·6H2O 0.507 g/L，MgSO4·7H2O 0.123 g/L，微量元素A51 mL/L，调节pH=7.5。

A5成份：50 mmol/LH3BO3，10 mmol/L MnCl2·4H2O， 0.8 mmol/L ZnSO4·7H2O， 1.0 mmol/L CuSO4·5H2O，2 mmol/L NaMoO4·2H2O，1.5 mmol/L NaVO3，0.8 mmol/L CoCl2·6H2O，加入40 mmol/L Tris-buffer，调节pH=7.5。

1.2 重离子辐照

取一定量对数期藻液离心（4 500 r/min，20 min）收集，弃上清液，收集沉淀藻体，将浓缩藻液用ASW 培养基洗涤3 次，最终浓缩藻液体积为1 mL，并转入辐照小皿中，用封口膜密封后进行重离子辐照。实验采用的重离子束能量为80 MeV/u，LET 为33 keV/μm，剂量率为20 Gy/min，吸收剂量分别为0 Gy、30 Gy、60 Gy、90 Gy、120 Gy、180 Gy、240 Gy、320 Gy。辐照后收集藻液，然后转入装有培养基的三角瓶中稀释培养，培养光照强度为200 μmol/(m2·s)，其余培养条件与1.1 节中一致。将重新培养的藻液分别在0～10 d 取一定体积离心收集（4 500 r/min，5 min）藻体，对相关指标进行测定。

1.3 盐生杜氏藻细胞干重的测定

藻细胞干重用滤膜法测定［15］。每组实验样品取出5～10 mL 藻液，用之前烘干（60 ℃，16 h）并预称重的玻璃微纤维滤膜（沃特曼GF/C 滤膜，直径47 mm）过滤，然后用0.5 mol/L NH4HCO3溶液（1～2 mL）洗涤3 次，烘干（60 ℃，16 h）后再次称重，前后两次的质量差与藻液体积之比即为细胞干重。

1.4 叶绿素荧光及叶绿素含量的测定

叶绿素荧光指标采用叶绿素荧光成像系统Water-PAM进行测定，先将装有待测样品的测量杯避光暗处理10 min，然后进行Fv/Fm、ΦPSII 和NPQ 等指标的测定［16］。叶绿素采用乙醇法进行测定［17］，取少量样品离心收集藻泥后加入1 mL无水乙醇，混匀后在78 ℃水浴锅中加热5 min，加热后样品放入避光环境中萃取叶绿素过夜，第二天样品离心（4500 r/min，5 min）后取上清液200 μL，加入96孔中置于酶标仪中测定波长645 nm和665 nm的吸光度值，根据式（1）计算叶绿素a 的质量浓度。

式中： Cchla为叶绿素a 的质量浓度，mg/L；A665为叶绿素a 的吸光度值；A645为叶绿素b 的吸光度值；11.75和2.35为经验公式校正值。

1.5 β-胡萝卜素含量的测定

改进的分光光度法用于测定生物质中的β-胡萝卜素含量［18］。将1 mL 细胞悬液在10 000 r/min下离心2 min。离心后，弃去上清液，加入3 mL正十二烷。剧烈摇动样品以重新悬浮藻类颗粒，然后加入9 mL 甲醇以完全裂解细胞，再次剧烈摇动试管，然后以10 000 r/min离心2 min。用分光光度计（Jasco V-530，JASCO 公司，日本）以正十二烷作为参考，在453 nm和665 nm下测量含十二烷的亲脂性β-胡萝卜素（上层）。β-胡萝卜素质量浓度计算见式（2）。

式中：Cβ-car为β-胡萝卜素的质量浓度，mg/L；（（A453-A665）/3.91）是针对叶绿素校正的β-胡萝卜素的吸光度；3.657 是从β-胡萝卜素浓度的高效液相色谱分析得出的校准系数；3是为萃取而添加的十二烷的体积，mL；X 是在分光光度计上测量吸光度的稀释倍数。

根据式（3）计算藻类生物量中β-胡萝卜素的质量百分数。

式中：fβ-car是β-胡萝卜素质量百分数，%；Cβ-car是β-胡萝卜素质量浓度，mg/L；CBiomass是细胞生物量，g/L。

2 结果与讨论

2.1 不同剂量重离子辐照对盐生杜氏藻生长的影响

如图1所示：野生的盐生杜氏藻株经过宽剂量范围（0～320 Gy）的重离子辐照处理后，藻细胞的生物量与重离子吸收剂量并无明显的相关性。吸收剂量为60 Gy、120 Gy和180 Gy时，藻细胞生物量的积累显著低于未辐照藻种的生物量。当吸收剂量为90 Gy、240 Gy和320 Gy时，生物量显著高于未辐照藻细胞的生物量。其中，当吸收剂量为240 Gy时，生物量最高可达1.12 g/L，是对照藻细胞生物量的1.78倍。这与Wang等［6］进行的重离子对羊角月牙藻类（Selenastrum capricornutum）的辐照诱变实验结果相似。

本研究中240 Gy 和320 Gy 辐照反而获得了更好的有利诱变藻株。这与国内外其他有关重离子在改良作物性状方面的结论有所区别。如Niwa等［19］认为低于150 Gy的吸收剂量更适合条斑紫菜（Porphyra yezoensis）高产突变体的诱变；此外钱平平等［20］采用不同吸收剂量重离子辐照大葱种子后，随着吸收剂量的增加，发芽率和株高呈现抛物线的趋势，这表明不同种属的实验材料对吸收剂量的耐受程度可能存在差异性。本研究初步表明：相对高的吸收剂量可能对盐生杜氏藻有益诱变的引发更加有效，并因此提升了细胞的光合效率，从而提高了藻细胞生物量的积累。

图1 不同剂量重离子辐照对盐生杜氏藻生物量的影响Fig.1 Biomass of Dunaliella salina after irradiation with heavy ions at various doses

2.2 不同剂量重离子辐照对盐生杜氏藻光合效率的影响

Fv/Fm可以表征微藻潜在的最大光合作用效率，以及光反应中心PSII 的完整性，并且直接反映了微藻是否受到环境条件的胁迫［21］。如图2（a）所示，盐生杜氏藻在不同剂量重离子辐照后Fv/Fm的变化整体呈现先降低后升高的趋势。各吸收剂量下，Fv/Fm值在0～2 d 下降，2～4 d 上升，4～10 d 缓慢下降。相比于对照组（0 Gy）的变化趋势，10 d后，240 Gy和320 Gy辐照诱变细胞的Fv/Fm值得到了显著提升，表明该组辐照处理的细胞可能获得了更多的有利诱变，使其光合作用效率得到了有效的提升，这与Wang 等［12］的研究结果相似。我们同时对辐照处理后藻细胞的实际光合活性参数ΦPSII的变化趋势进行了测定和分析（图2（b）），结果表明，ΦPSII在整个辐照处理后10 d内的变化趋势与Fv/Fm值基本一致，整体呈现先减小后增加再下降的变化趋势，其中，90 Gy和240 Gy处理后10 d的ΦPSII值显著高于对照组（p＜0.05）。

NPQ 参数是指非光化学淬灭能力，当微藻细胞接收到的光子超过自身所利用的光子时，便会以热辐射效应（即通过荧光和热量的形式）将多余的光子释放出去，保护微藻细胞免受光损伤［6，12］。NPQ 既反映了光系统对激发能的热耗散水平，同时还能够用来表征微藻叶绿体类囊体膜的激发状态和光保护能力［22］。我们对不同吸收剂量重离子辐照盐生杜氏藻处理后10 d 内NPQ 的变化趋势进行了测定和分析。如图2（c），所有处理组的NPQ 整体呈现先增加后降低再增加的趋势，辐照后2 d 内，盐生杜氏藻即启动了光保护机制，此周期内，200 μmol/(m2·s)的正常培养光强已经超过微藻细胞的光利用能力。与对照组（0 Gy）相比，30 Gy、60 Gy、120 Gy 和180 Gy 辐照处理的藻细胞的NPQ 水平都大幅上升，表明这些辐照处理的藻细胞的光合系统受到了更严重的损伤，而240 Gy辐照处理的藻细胞的NPQ水平则相对较低。而在此后2～8 d的培养周期内，所有藻细胞的NPQ值逐步下降（2～4 d）并恢复到了稳定状态（4～8 d）。在整个恢复周期内，240 Gy 辐照处理的藻细胞始终维持了比对照组更低的NPQ 值。因此，240 Gy辐照处理的藻细胞表现出低的NPQ 值，可能是由于辐照导致了叶绿体结合蛋白的过表达，进而使类囊体膜发生了重组，提升了光能转换效率，并因此有效降低了藻细胞的热耗散能量［12］，致使藻细胞更快地启动了光保护机制，在光反应阶段完成了更多光能的转换，有效地提升了光能利用效率，积累了更多的细胞生物量和代谢产物。

不同吸收剂量引发的微藻细胞光合作用效率的差异可能归因于以下两个重要的因素：其一是诱变后，细胞可能通过光电子传递速率和热耗散能力的调控实现了能量的动态平衡，进而影响了微藻细胞整体光合作用效率的差异［12］；其二，Bonente 等［23］的研究表明，蓝藻细胞受到损伤后，细胞启动的修复机制导致光能捕获通路中相关色素合成基因和色素结合蛋白的表达发生了改变，介导PSII 的修复机制来提高光合作用的能力进而影响了微藻细胞整体光合效率。

图2 不同剂量重离子辐照对盐生杜氏藻的叶绿素荧光参数的影响：(a)Fv/Fm；(b)ΦPSII；(c)NPQFig.2 Chlorophyll fluorescence parameters of Dunaliella salina after irradiation with heavy ions at various doses:(a)Fv/Fm;(b)ΦPSII;(c)NPQ

2.3 不同剂量重离子辐照对盐生杜氏藻色素积累的影响

盐生杜氏藻细胞受不同剂量重离子辐照处理后，我们对10 d内藻细胞中叶绿素a的含量变化进行了跟踪检测。如图3（a）所示，叶绿素a含量呈现先升高后降低的整体趋势，其中90 Gy、240 Gy和320 Gy 辐照处理后的藻细胞叶绿素a 在2 d 内的积累量显著高于对照组（0 Gy），在随后的培养周期内逐渐降低，但这3个处理的藻细胞叶绿素a积累量始终高于对照组。由图3（c）得知，其中在240 Gy 和320 Gy 辐照处理的藻细胞后叶绿素a 产量在第10 d 内的积累量显著高于对照组（0 Gy），同时，240 Gy 和320 Gy 组叶绿素a 产量之间并无显著性差异（p＞0.05）。

本研究同时探究了不同剂量重离子辐照后盐生杜氏藻细胞内的β-胡萝卜素含量的变化。如图3（b）所示，在整个培养周期内，β-胡萝卜素的积累呈现增加的趋势，其中90 Gy、240 Gy和320 Gy在10 d 内的β-胡萝卜素积累量显著高于对照组（p＜0.05）。其中，对照组中β-胡萝卜素的产量为10.8 mg/L，90 Gy、240 Gy和320 Gy在10 d内的β-胡萝卜素产量分别为17.7 mg/L、24.8 mg/L 和22.9 mg/L（图3（d）），与对照组（0 Gy）相比，两个高剂量重离子辐照240 Gy 和320 Gy 处理后的盐生杜氏藻细胞内β-胡萝卜素产量分别提高了1.3倍和1.1倍（图3（d）），而其他吸收剂量（30 Gy、60 Gy、120 Gy、180 Gy）处理的藻细胞内β-胡萝卜素积累量则显著低于对照组。这与叶绿素a积累量的变化趋势具有相似性。β-胡萝卜素作为捕光色素蛋白复合物的重要组成之一，在淬灭激发态的3Chl*分子中发挥重要作用，同时β-胡萝卜素还可以消除产生的过多自由基，保护微藻细胞免受氧化损伤［9］。相关研究表明，重离子辐射从开始照射到生物损伤的过程大致可以分为4 个阶段：物理阶段、化学阶段、生化阶段和生物阶段。在物理阶段，射线的能量在极短的时间（10-16s）内沉积在生物体中，使生物分子和生物介质中的水分子发生电离和激发，产生大量的自由基；在化学阶段，自由基与多种生物分子相互作用引起链式反应（通常在10-3s内），最终导致生物分子尤其是DNA分子结构和功能的改变［5，19］。β-胡萝卜素作为效应分子可能参与了微藻细胞光合效率的动态调控［24］。通过β-胡萝卜素的大量积累有效地抵制和清除了过量自由基对细胞的损伤。此前相关报道证明，重离子辐照可以更高效地引发DNA 断裂、重组和突变，并因此提升有利突变的概率［6，25-26］。我们推测，重离子辐照高剂量诱变可能致使藻细胞中β-胡萝卜素代谢通路中的相关基因表达上调，也可能β-胡萝卜素合成途径中的相关酶通过诱变积累了更多的有利突变，活性得到了提升。我们在后续的研究中，将对该诱变藻株在转录组和代谢组水平上进行进一步深入的研究。

图3 不同剂量重离子辐照对盐生杜氏藻的色素含量的影响：(a)叶绿素a含量；(b)β-胡萝卜素含量；(c)叶绿素a 产量；(d)β-胡萝卜素产量Fig.3 Pigment of Dunaliella salina after irradiation with heavy ions at various doses:(a)Chl a content;(b)β-carotene content;(c)Chl a yield;(d)β-carotene yield

3 结论

本文初步探讨了重离子辐照对盐生杜氏藻的生物学效应及藻细胞对辐照损伤的光合响应机制。结果表明：高吸收剂量的辐照对盐生杜氏藻具有更好的诱变效应，240 Gy 吸收剂量显著提高了盐生杜氏藻的生物量，产量最高可达1.1 g/L。同时240 Gy 和320 Gy 吸收剂量有效提高了盐生杜氏藻的Fv/Fm、ΦPSII，同时使藻细胞获得了更低的NPQ。表明藻细胞受到诱变损伤后，会通过热耗散效应启动能量的动态调控。其中，240 Gy 的吸收剂量有效诱导了盐生杜氏藻细胞中代谢产物β-胡萝卜素的积累，产量最高达到24.8 mg/L，比对照组提高了1.3 倍，β-胡萝卜素的高效积累能使其有效清除活性氧自由基，阻止了重离子辐照对光合系统的损伤，是盐生杜氏藻对重离子辐照的另外一种重要响应机制。