海南油茶不育株花器发育生物学特性及解剖学观察

贾泽冲 刘云豪 陈霞 王海 邓雅洁 胡新文 周扬 庞真真 赖杭桂

摘  要：从解剖学、细胞生物学及遗传学角度对海南油茶不育株花器发育过程导致不育的原因进行研究。以海南油茶正常株和不育株为实验材料，对其花芽发育过程外部形态特性进行阶段性比较观察，并应用花粉原位萌发技术检测其花粉萌发及花粉管发育差异;应用石蜡切片法对花芽分化过程中雌雄蕊进行解剖学观察，分析雌雄蕊发育时期与其花芽外部形态的相关性。结果表明：不育花与正常花外部形态上并无明显差异，但不育株开花后子房即脱落，表明没有正常授精，不育株柱头授粉后花粉粒不萌发，花粉管并不伸长;从雌雄蕊石蜡切片可以看出，不育株花器发育失常，其花药的绒毡层降解异常，无法形成成熟花粉粒，而在其胚珠发育过程中不育株未能形成成熟胚囊，导致空心胚珠。

关键词：海南油茶;不育株;花器;花粉原位萌发;解剖学观察

中图分类号：S794.4      文献标识码：A

Abstract： The flowering sterility of Camellia vietnamensis is common in Hainan， which would seriously affect the production level of Camellia oil. In this study， the normal and sterile plants of C. vietnamensis in Hainan were used as the experimental materials， the external morphological characteristics of flower bud development were compared and observed， and the differences of pollen germination and pollen tube development were detected by the pollen in situ germination technique. The paraffin section method was used to observe the pistil and stamen during flower bud differentiation， and the correlation between the period of pistil and stamen development and the external morphology of flower bud was analyzed. In this study， the causes of sterility caused by flower organ development of C. vietnamensis in Hainan were analyzed in developmental biology， reproductive genetics and cell anatomy. There was no significant difference in the external morphology between the sterile flower and the normal flower， but the ovary of the sterile plant fell off after flowering， indicating that there was no normal insemination， the pollen grain did not germinate and the pollen tube did not elongate after stigma pollination. From the paraffin sections of pistil and stamen， it could be seen that the flower organ of the male sterile plant was abnormal， the tapetum of the anther was abnormally degraded and could not form mature pollen grains， but the sterile plant failed to form a mature embryo sac in the process of ovule development， resulting in hollow ovules.

Keywords： Camellia vietnamensis; sterile plant; floral organ; pollen in situ germination; anatomical observation

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.09.013

油茶為山茶科（Theacea）山茶属（Camellia）多年生木本油料作物，由虫媒异花授粉的双子叶植物，是典型的花果同时发育多年生常绿树种，我国重要的木本油料树种之一，主产于我国南方各省，在我国已有两千多年的栽培历史[1-3]。海南油茶（俗称“山柚”）与内地普通油茶具有明显区别，目前，学术界普遍认为海南油茶泛属越南油茶种（Camellia vietnamensis T. C. Huang ex Hu），越南油茶主要分布在我国的海南省、广东南部，以及越南、老挝等地，也称为陆川油茶，民间俗称高州油茶、大果油茶、白花油茶[4]。海南的茶油，亦称“山柚油”，香气浓郁、营养价值高，具有“东方橄榄油”之美称[5-6]。海南地处热带地区，因此种植海南油茶具有巨大的经济价值及发展优势。近年来，我国食用油供需矛盾突出，而油茶作为我国特有的木本油料作物，雌雄同花，异花授粉且产品为果实，其产业经济效益差、产量低等问题明显[7-8]，并且目前海南栽培种植区大多为实生树，由于低产实生树产果量少、出油率低，大小年现象明显，大面积种植的油茶实生树严重制约了海南油茶产业的发展，因此，选育和推广油茶优良无性系种植材料显得十分重要。

在海南油茶实生树群体中，油茶不育株现象普遍存在，花器败育而导致开花不结实是造成油茶林低产的重要因素之一。通过对海南油茶不育株花器发育过程进行观察研究，不仅可揭示油茶不育株不育的生殖学原因，为油茶实生树低产林改造提供生产依据，而且还可通过对油茶花器不育遗传机制的研究，利用其雄性或雌性不育的遗传特性，进行有性杂交育种及创新油茶杂种优势利用途径。

近年来，有关植物花粉原位萌发技术已普遍应用于农作物、蔬菜、花卉、林木等有性生殖与杂交育种研究[9-12]。也有研究人员就普通油茶的花粉形态结构扫描电镜观察、雄性不育优良无性系选育、雌性不育原因探讨等方面进行了少量研究[13-15]，但海南油茶不育株花器官发育方面的研究鲜有报道。本实验以海南油茶正常株和不育株为实验材料，从解剖学、细胞生物学及遗传学角度对海南油茶不育株花器发育过程导致不育的原因进行研究。对其花芽发育过程外部形态特性进行阶段性比较观察，并应用花粉原位萌发技术检测其花粉萌发及花粉管发育差异;应用石蜡切片法对花芽分化过程中雌雄蕊进行解剖学观察，分析雌雄蕊发育时期与其花芽外部形态的相关性。初步揭示海南油茶花器不育的相关细胞学遗传机制，不育株不育的生殖学原因，为海南油茶实生树低产林改造提供生产依据;利用其不育遗传特性来进行有性杂交育种，可为今后创新油茶杂种优势利用途径等方面的研究奠定基础。

1  材料与方法

1.1  材料

供试材料于2018年12月采自海南省澄迈县福山镇侯臣生物科技有限公司油茶种植基地，不育株与正常株树龄15 a，树势中等，不育株开花但不结果，正常株生长结果正常。基地位于1923N，10900E，海拔21～300 m，年平均气温23.1～ 24.4 ℃，年平均雨量2000～5000 mm左右，平均相对湿度89%，年平均光照1900 h。试验基地肥水条件良好，立地条件和管理措施完全一致。

1.2  方法

1.2.1  花粉原位萌发方法  试验在植株开花当天2018年12月28日进行，分别以海南油茶正常株和不育株为母本，采集其他正常株花粉进行异株授粉并套袋隔离，以避免油茶自交不亲和性的影响。在授粉后5 h开始采样用于比较观察柱头上花粉粒萌发及花粉管生长。

参照Burke[16]和Hiratsuka等[17]的花粉原位萌发方法，并作部分修改，具体流程如下：分別于授粉后5、10、20 h取样，每次取海南油茶正常花和不育花各5朵，去除萼片后取柱头连同子房在卡诺氏固定液（V95%乙醇：V冰醋酸=3：1）中固定24 h，取出柱头用95%乙醇洗涤3～4次，置于70%乙醇容器中，4 ℃冰箱中保存备用。观察时，柱头用2 mol/L NaOH软化1 h，蒸馏水冲洗3次以上，再用1%水溶性苯胺蓝染色8～12 h，然后把柱头置载玻片上，滴适量蒸馏水，加盖玻片轻轻压平，用荧光显微镜Olympus BX51TR-32FA1-A03在WU （宽带紫外光激发）下进行观察，Image-Pro Plus软件拍照。由于油茶的花柱较长，所以图片先局部拍照，然后用Photoshop软件拼接成完整花柱图。

1.2.2  海南油茶正常株与不育株花器形态及解剖学差异观察  （1）海南油茶正常株和不育株花芽外部形态观察及测量。油茶的内部发育时期和花芽或花形态特征之间存在着一一对应的关系[1]。观察供试材料外部形态差异，把花芽从小到大不同发育时期分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4级，即Ⅰ级：花芽开始萌动，芽鳞坚硬且有开裂趋势;Ⅱ级：芽鳞张开，稍微露蕾;Ⅲ级：芽鳞脱落，花蕾露出;Ⅳ级：花朵含苞待放，个别花朵已开放。按照4级外部形态差异进行取样，样品采自树冠外围短枝上的花芽，每次采正常株与不育株花芽各30个（花芽大小均匀一致），自花芽萌动开始进行采样（Ⅰ级），根据花芽发育速度，每3 d采样1次，采样时间为上午9：00—10：00时，集齐Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4级样品。每级随机选取正常株与不育株花芽各20个，对其纵径（长）和横径（宽）采用游标卡尺进行测量，取平均值（mm）进行生长发育不同时期的花型指数（花芽纵横径之比）差异显著性分析。

（2）石蜡切片方法。参照杨虎彪等[18]的植物石蜡制片改良方法，并作部分修改，具体流程如下：采集新鲜材料固定于FAA固定液中（70%乙醇 ：甲醛 ：冰醋酸=90 ： 5 ：5），抽气，固定24 h。用70%乙醇洗涤3次后，用梯度浓度为70%～100% 的乙醇彻底脱水。经脱水后再通过梯度性改变正丁醇和酒精比（置于正丁醇：无水乙醇=1： 1中1 h，取出，转入正丁醇中静置1～2 h，再取出转入正丁醇中放置1～2 h）以进行透明处理。然后将材料浸蜡，浸蜡结束后便立即包埋材料，修块，将材料固定在LEICA RM2235切片机上（厚度调至10 μm）手摇切片，置于展片台上展片，45 ℃烘片12 h以上。烘片后用有机溶剂（二甲苯和乙醇）逐步脱蜡。最后采用固绿或者番红固绿对染，并以中性树胶封片保存。使用Olympus BX51显微镜观察切片并拍照。

2  结果与分析

2.1  花粉萌发及花粉管发育特征观察

荧光原位萌发的观察结果显示，海南油茶正常株的花粉粒萌发及花粉管生长正常（图1A），但不育株柱头上的花粉粒几乎不萌发，花粉管不发育（图1B）。正常株授粉后，花粉萌动首先从花粉的萌发孔突出花粉管，萌发的花粉管呈亮绿色，基部管节有时可见明显膨大（图1D）。花粉管进入花柱引导组织后向下呈直线生长（图1C），显微镜下可见大量花粉管成束状于花柱中（图1A）。在生长的过程中，花粉管只在长度上持续增加，而直径变化不大。不育株授粉后，花粉管不伸长，没有花粉管能够到达柱头底部，穿过子房完成受精。

2.2  海南油茶正常株与不育株花器形态及解剖学差异

2.2.1  油茶正常花与不育花形态差异  正常花和不育花分别选取4个发育时期：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，各时期花芽外部形态见图2 A和B（时期Ⅰ：花芽呈绿色，鳞片硬;时期Ⅱ：花芽体积增大，绿色变浅;时期Ⅲ：芽鳞开裂，露出嫩黄花瓣;时期Ⅳ：花芽开绽，芽鳞黄绿色且张开，露出白色花瓣）。正常株花药饱满呈黄色，有黄色粉末狀花粉粒散出;而不育株花药瘦小干缩，颜色呈褐色，非正常色泽，且无花粉粒散出（图2C）。比较正常株与不育株的子房发育，可见正常株子房发育膨大，而不育株开花几天后子房干瘪即将脱落（图2D）。

通过对海南油茶正常株和不育株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4个生长发育时期花芽的纵横径进行测定（图3），方差分析结果表明，各个时期不育株花芽纵横径均值，均显著高于正常株花芽纵横径均值，但未达到极显著差异，因此从花芽外观上可以初步判断不育株花器要略微大于正常株花器。

对正常花和不育花生长发育4个不同时期的花型指数（纵径/横径）进行比较分析。结果显示，正常花和不育花的花型指数在花芽生长发育过程的4个时期差异都不显著（表1），其花芽形状、鳞片、花瓣颜色等发育一致（图2A、B），表明2种类型的花芽在各发育阶段是一致的，其花型指数的外观形态并不存在明显差异。

通过对比油茶正常花和不育花外部形态，明显看出不育花的雄性器官结构异常（图2C）。不育花花药瘦小干缩，颜色呈褐色，非正常色泽。从外部形态分析，不育原因为结构性雄性不育。除此以外，海南油茶正常株与不育株开花后子房形态差异也非常显著，正常株开花后子房正常发育膨大，然而不育株开花后子房干瘪，且有脱落趋势（图2D）。

2.2.2  正常株与不育株的花药发育观察  采用石蜡切片法来比较观察正常花和不育花的解剖学差异。4个发育时期正常花和不育花花药结构的对比观察情况见图4。

正常株油茶花粉壁的发育属基本型，花粉壁由表皮层、药室内壁、中层和绒毡层组成，将花粉母细胞围绕在其中心。随着减数分裂后胼胝质降解，单核小孢子从四分体中游离出来。刚释放出来的单核小孢子排列不规则，细胞壁薄，细胞质浓，细胞核位于细胞中央，绒毡层降解，开始脱离中层（图4A）;正常株单核小孢子继续发育，体积增大，大多数细胞核从细胞中心移至细胞一侧，花粉发育的单核靠边期形成，此时，绒毡层继续降解（图4B）;接下来正常株小孢子进入有丝分裂，生成2个核，表面略微凹陷，形成2个细胞，即相对较小的生殖细胞和较大的营养细胞，此时，花粉发育进入二核时期，双核花粉积累营养物质，颜色较深，绒毡层进一步解体，绒毡层核消失，内含物消失（图4C）;正常株逐渐进入花粉成熟时期，花粉粒形态均匀，体积增大，染色深，充满营养物质，两个相邻的花粉囊相通，绒毡层完全解体消失（图4D）。

不育株花药同样具有表皮层、药室内壁、中层和绒毡层结构，但不明显。相比之下，4个时期不育花花药结构中，几乎观察不到发育正常的花粉粒，绒毡层几乎未降解，内含物未消失，乃至两个相邻花粉囊均相互连通的成熟时期，绒毡层依然存在（图4 E～H）。绒毡层是花药的一种特化组织，位于花粉囊壁最内层，其主要功能是产生和输送给小孢子正常发育所必需的酶、生长素和营养物质，为花粉粒的发育提供代谢所需要的物质，对花粉的形成起着关键的作用。绒毡层发育不正常是导致花粉败育的一个主要原因，绒毡层细胞发育畸型，导致营养物质滞留在绒毡层细胞内部，无法运输到小孢子中，使得花粉发育得不到正常生长所需的营养物质，引起败育[1]。

2.2.3  正常株与不育株的胚囊发育观察  正常花和不育花胚囊结构的对比观察情况见图5。正常花时期Ⅰ处于大孢子母细胞时期，大孢子母细胞体积大，核大，细胞质较浓，位于一层珠心表皮下（图5A）;接下来功能性大孢子中心出现椭圆形的大液泡，细胞核进行第1次减数分裂，形成二分体（图5B）;保留的二分体继续完成减数Ⅱ分裂，形成的二核胚囊继续有丝分裂，即将形成四核胚囊（图5C）;正常花的时期Ⅳ胚囊里，可观察到趋于成熟的胚囊结构（图5D）。而不育株出现明显的胚囊异常，未能形成大孢子母细胞（图5E），减数分裂不能起始或完成（图5F），处于发育成熟的胚囊绝大多数胚珠中心是空的，未见卵细胞、极细胞及反足细胞，无形成正常胚囊的趋势（图5G～H）。导致植物产生雌性不育的原因有很多，胚珠作为种子的前体器官，其败育会产生最直接和最彻底的影响，导致雌性不育或育性降低。胚囊自身发育异常，大孢子母细胞不能形成，减数分裂不能起始或完成，这是胚珠败育的主要类型[19]。

2.2.4  海南油茶雌雄蕊发育时期与其花芽外部形态的对应关系  本试验海南油茶4个发育时期花芽的外部形态变化主要表现为芽鳞坚硬且有开裂趋势（时期Ⅰ）;芽鳞张开，稍微露蕾（时期 Ⅱ）;芽鳞脱落，花蕾露出（时期 Ⅲ）;花朵含苞待放（时期 Ⅳ）。

海南油茶雌雄蕊发育时期和花芽或花形态特征之间存在着一定的对应关系（表2）。通过观察外部形态和石蜡切片图，不难看出，时期Ⅰ，芽鳞坚硬（图2A），此时胚珠内孢原细胞发育成为大孢子母细胞（图5A），雄蕊发育处于单核小孢子中央期（图4A）;时期Ⅱ，芽鳞张开，稍微露蕾（图2A），雌蕊发育至二分体时期（图5B），雄蕊发育进入单核花粉时期（图4B）;时期 Ⅲ，芽鳞脱落，花蕾露出（图2A），细胞活动活跃，雌蕊开始形成二核或四核胚囊（图5C），花药内部进入二核花粉时期（图4C）;时期 Ⅳ，花朵含苞待放（图2A），出现成熟胚囊（图5D），且雄蕊花粉发育成熟（图4D）。

3  讨论

花粉在柱头上的萌发及生长状况是杂交亲和性的一项重要内容，花粉萌发和花粉管生长也是实现受精作用的首要步骤，在高等植物有性生殖过程中起重要作用[20-22]。本研究采用花粉原位萌发技术，授粉后采下柱头，通过苯胺蓝染色法对花粉管进行染色，可有效在荧光显微镜下观察到油茶花粉粒在柱头上萌发及花粉管生长情况。运用花粉管荧光标记能够直接判断高等植物在自交、异交过程中花粉萌发及花粉管的生长情况[11]。苯胺蓝能够有效地标记花粉管，花粉管在花柱区内穿行时产生大量的胼胝塞，产生强烈荧光，因此采用荧光显微镜法能快速测定植物授粉的亲和性[23]。研究发现，海南油茶正常株和不育株间花粉粒萌发及花粉管生长情况存在差异。海南油茶正常株的花粉粒萌发及花粉管生长正常，海南油茶不育株的花粉粒几乎不萌发，花粉管不发育。由此可见，海南油茶不育株花粉萌发和花粉管生长不正常，其受精作用受阻。

植物的有性生殖对于其生命的延续和种群的拓展起着决定性的作用，该过程的任何一个环节出现障碍，都会造成生殖的失败[1]。通过海南油茶正常花和不育花外部形态观察对比可以看出，虽然两者在花芽外部形态上并无明显差异，但不育花花药瘦小干缩，颜色呈褐色，非正常色泽，为结构性雄性不育;从解剖观察海南油茶正常株及不育株的發育过程表明，海南油茶正常株的花药和胚囊结构发育完全正常，但切片观察海南油茶不育株几个相同发育时期，其雌雄蕊败育现象明显，有别于正常株：4个时期正常株花药结构分别处于单核时期、单核靠边期、二核时期和花粉成熟期，各部分结构发育正常，但分别对应的不育花花药的绒毡层发育和降解异常，到达花粉成熟期两个相邻花粉囊虽均相互连通，但均未形成成熟花粉粒;4个时期正常株胚囊结构分别处于大孢子母细胞时期、二分体时期、二核胚囊有丝分裂期、成熟胚囊期，而不育株出现明显的胚囊发育异常。花粉的正常发育是实现受精结实的保证。然而，植物群体中存在花粉败育的个体，导致雄性不育[24]。究其败育的原因，绒毡层发育和降解的异常，往往会影响花粉粒的正常发育，有研究认为花粉败育是由于绒毡层细胞在花粉形成和发育过程中提前或延后退化[25]。绒毡层解体后其产物可以为花粉合成 DNA、RNA、蛋白质、淀粉等提供原料，因此绒毡层发育异常会影响小孢子发育，最终导致花粉部分或完全败育[26]。胚囊发育异常，会导致雌性不育或育性降低[20]。因此判定海南油茶不育株不育原因为有性生殖过程中，雄性生殖结构与雌性生殖结构发育异常，使得无法形成成熟胚囊及成熟花粉粒，受精过程严重受阻，造成生殖失败，形成海南油茶不育株。陈永忠等[14]研究普通油茶观察到植株雄性不育，但是雌性正常，异花授粉后可正常开花结实，而本研究观察到海南油茶开花不结实现象，经实验证明为雌雄均表现不育性。

海南油茶花期长，花量大，但实生树结果少甚至不结果现象是造成海南油茶低产的关键因素，也制约了海南油茶产业的发展。该种植基地有6.67 hm2 15龄实生油茶林，不育株比例约占3%～5%。油茶作为多年生的木本油料作物，优质、高产始终是油茶研究的重要目标。为推进油茶优质、高产，更要重视海南本地油茶的优株筛选，加快海南油茶品种选育，大力推广本地区优良品种，同时加强油茶林科学管理，良种良法，培育新一代高产、优质聚合品种，以油茶高产优质为目的，为海南油茶的大面积推广和丰产栽培奠定基础。

本研究通过对海南油茶不育株及正常株花粉原位萌发及花器发育过程进行解剖学观察，分析油茶不育株在花器形态、结构及其大小孢子形成方面与正常株的差异，初步揭示了发生油茶花器不育相关的遗传机制，为海南油茶正常株和不育株的发育特性差异方面积累一些原始资料，对海南油茶的遗传学研究有着重要的指导意义。从海南油茶生殖发育过程可以看出，准备开花及开花期间是性细胞发育的重要时期，此时正值雌雄配子体的发育阶段，需要营养供应充足、环境条件良好以满足其进行生殖发育。下一步的研究应对海南油茶不育株从转录组方面进行测序和分析，对导致不育的基因进行相关探讨，以期利用其雄性或雌性不育的遗传特性，进行有性杂交育种，创新油茶杂种优势利用途径，为油茶实生树低产林改造提供生产依据，早日建立高产、稳定的油茶体系。

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