基于网络药理学探究芪芍通脉汤治疗冠心病的作用机制

朱春临，吴佳芸，李瑞菡，景瑞青，黄 力

冠状动脉粥样硬化性心脏病简称冠心病，是由于冠状动脉狭窄导致心肌细胞缺血、缺氧或坏死所引起的心脏病，现代临床将其分为稳定型冠心病和急性冠脉综合征，治疗主要有基础药物治疗、经皮冠状动脉介入治疗、行冠状动脉旁路移植术，不论是否行血运重建，基础药物治疗仍是一切治疗的基础[1]，但目前单纯西药治疗存在部分疗效欠佳、临床症状改善有限、安全性有待加强等问题。近年来有研究表明，中药复方在治疗疾病，改善症状方面存在一定优势，为临床药物选择扩展了空间，故行中西医结合治疗即“病证结合”是临床较佳模式[2]，能够最大限度地使病人获益。中医学认为，冠心病属“胸痹”“心痛”“真心痛”范畴，基本病机以气虚为本、血瘀为标。芪芍通脉汤为黄力教授临床治疗冠心病的经验用方，立方以补虚为主，同时配合活血化瘀安神之品，作为临床治疗冠心病基础方剂，经临床验证效佳；但该复方治疗冠心病的有效活性成分及作用机制尚不明了，有关复方药理学研究仍处于单药研究阶段，故此采用网络药理学方法，分析复方化学成分、作用靶点及信号通路，为后期动物实验及临床应用提供参考。

1 资料与方法

1.1 复方化学成分和靶点信息收集 以口服生物利用度(OB)>30%、化合物类药性(DL)>0.18为筛选条件，从中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/ tcmsp.php)分别检索黄芪、赤芍、川芎、降香、葛根、酸枣仁共6味药物的化学成分及相关成分的潜在靶点。

1.2 疾病相关靶点的信息收集 通过GeneCards数据库(http：//www.genecards.org)、OMIM数据库(http：//www.omim.org)进行检索，获得冠心病相关靶点，收集整理后建立冠心病相关靶点数据集。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建 将疾病靶点与药物成分靶点进行交集处理，获得疾病-药物共同靶点，绘制韦恩图。将筛选到的疾病-药物共同靶点导入STRING数据库(https：//string-db.org)，限定物种为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值设为中等“highest confidence”(>0.9)，构建PPI网络模型。

1.4 网络构建与分析 通过Cytoscape 3.7.2软件，将复方治疗冠心病的作用靶点数据库进行“成分-疾病-药物”网络构建，通过分析网络节点的节点中心度(degree)、中介中心性(between ness centrality，BC)和接近中心性(closeness centrality，CC)等网络拓扑参数筛选核心节点，以此探究成分-疾病-药物之间的网络相关性，其中选取条件设置为≥平均数。为明确复方治疗冠心病的作用靶点在生物信号通路中的作用，将筛选到的数据导入DAVID数据库(https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp)，进行KEGG通路富集分析及GO功能富集分析。选取排名前20位的生物过程和通路，结合文献检索，筛选出治疗冠心病的可能通路。

2 结 果

2.1 芪芍通脉汤化学成分及其靶点与疾病靶标的筛选 通过TCMSP数据库检索全方，同时检索中国期刊全文数据库(CNKI)、中文科技期刊全文数据库(VIP)、万方知识服务平台、PubMed等数据库，剔除无靶点化合物，共得到有效成分106个，其中黄芪20个、赤芍29个、川芎7个、葛根4个、酸枣仁9个、降香37个。通过TCMSP数据库对有效成分进行靶点预测，去除重复值后，筛选出453个相关靶点，其中黄芪86个、赤芍74个、川芎18个、葛根37个、酸枣仁17个、降香221个。通过GeneCards、OMIM数据库进行检索，共搜集到3 175个冠心病相关靶点。

2.2 PPI网络构建 将453个药物成分靶点与3 175个疾病靶点两者取交集，同时绘制韦恩图(见图1)，共得到66个疾病-药物成分共同靶点。将66个疾病-药物共同靶点输入String数据库，获取PPI网络，共获得66个节点、559个相互关系，其中平均节点16.9个，期望边数144个。图中节点表示蛋白，边表示蛋白之间的关联。详见图2。

2.3 有效成分-靶点-疾病网络分析 在Cytoscape 3.7.2软件中导入有效成分、靶点、疾病的相关信息，构建有效成分-靶点-疾病网络图(见图3)。在该网络中，浅绿色代表有效成分，紫色代表共同靶点，蓝绿色代表复方，红色代表疾病。节点代表活性成分、靶点、疾病，边代表三者之间存在的相关关系。节点面积大小与Degree数值大小成正比，节点与其他节点连接较多的靶点是关键靶点。同时根据分析网络节点的Degree、BC、CC筛选出相关靶点。详见表1。

图1 疾病-成分靶点韦恩图

图2 复方靶点PPI网络

表1 靶点的网络拓扑学参数

2.4 芪芍通脉汤作用机制分析 将复方治疗冠心病的相关靶点导入DAVID数据库进行GO及KEGG通路富集分析，以P< 0.01 为阈值筛选富集数量较多的通路与生物过程，其中富集占相应通路比例越大、P值越小的通路，与复方中活性成分治疗冠心病的关系更密切。详见图4、图5。复方分子功能主要有DNA结合转录活性，RNA聚合酶Ⅱ特异性、泛素样蛋白连接酶结合等。KEGG分析结果示多个生物过程与冠心病的发生发展密切相关，其中主要富集于流体剪切应力和动脉粥样硬化、AGEs-RAGE信号通路(AGEs-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、IL-17信号通路(signaling pathway)、EB病毒感染(Epstein-Barr virus infection)、细胞凋亡(apoptosis)、人类巨细胞病毒感染(human cytomegalovirus infection)等。

图3 有效成分-靶点-疾病网络图

图4 主要成分潜在靶点参与的生物学过程分析

图5 KEGG通路富集分析

3 讨 论

芪芍通脉汤为黄力教授临床治疗冠心病经验方，主以补气活血、化瘀安神。黄力教授认为冠心病为本虚标实之证，气虚为本，血瘀为标，血瘀日久化热伤津；又心主神志，心气血不充，神志不安，故处方用药应主次分明；方中以黄芪为君，其味甘性微温，取其补气行气之力，临床应用以生品为多，用量为30～90 g；川芎、赤芍、降香相使为臣，主以活血化瘀止痛；葛根生津舒筋、枣仁养血安神共为佐。现代药理研究发现，黄芪富含多种微量元素，可通过其正性肌力作用、降低心肌耗氧量、提高心肌抗氧化能力等多种机制联合作用从而达到保护缺血损伤心肌的目的[3-4]；川芎在保护血管内皮、抗动脉粥样硬化、抗心肌缺血再灌注损伤、抗炎、抗氧化应激等方面表现突出；川芎嗪注射液可以改善冠状动脉的血液循环，减轻缺血引起的心肌细胞损伤[5-6]；赤芍可增加冠状动脉血流量，增加心排血量，抗实验性心肌缺血，改善微循环，同时发现赤芍可阻碍动脉损伤后内膜增生，抑制平滑肌细胞增殖[7]；葛根能扩张冠状动脉，缓解血管压力，葛根素具有清除氧自由基、抗氧化、减少心肌耗氧量、减低血液黏度、抗动脉粥样硬化、改善缺血心肌及周围循环血液供应等作用[8]；降香可降低血瘀动物的血液黏度，改善心肌重构，抗血栓、血小板聚集，舒张血管、抗氧化[9-10]；动物实验证明，酸枣仁能够镇静、催眠、抗惊厥，抗实验性心肌缺血，降低胆固醇[11-12]。各单药经现代药理研究证明均具有保护心脏的作用，但复方治疗冠心病的靶点通路尚不明了。

本研究通过拟合复方治疗冠心病的“有效成分-靶点-疾病”拓扑网络，发现与复方关联度较大的化学成分主要有槲皮素、β-谷甾醇、黄芩素、刺芒柄花素、鞣花酸、杨梅酮、谷甾醇、豆甾醇、异黄烷等，其中现代药理研究发现槲皮素可阻止缺氧后肺动脉高压、右心室肥大，改善心肌重构，抑制PASMCsd的异常增殖，从而改善心肺功能[13]；β-谷甾醇具有抗氧化、抗炎、降低胆固醇作用[14-17]；刺芒柄花素在体内具有雌激素样作用、降血脂、抗脂质过氧化，能够改善动脉粥样硬化，清除氧自由基，抑制血管平滑肌细胞增殖等作用[18-22]；鞣花酸可以有效抗动脉粥样硬化、抗炎、抗氧化[23]。临床药理研究发现，异黄酮在降糖降脂、改善胰岛素抵抗、抑制相关葡萄糖代谢酶活性和抗糖尿病氧化损伤等方面表现突出[24-25]。关联度较大的化学成分有可能是复方治疗冠心病的主要成分；通过网络拓扑学及生物学功能分析，综合排名前10位的靶点分别为PTGS1、ESR1、PPARG、ESR2、PGR、AR、GSK3B、NCOA1等靶点，主要具有调节激素分泌、抗凝、调脂、改善认知状态等作用[26-31]，表明该类靶点可能是复方治疗冠心病的主要靶点，这些靶点多为参与流体剪切应力和动脉粥样硬化通路、AGEs-RAGE信号通路、IL-17信号通路、EB病毒感染等多条信号通路的关键基因，其通过调节细胞增殖与凋亡、炎症反应、激素水平、脂质代谢等可能机制，发挥协同治疗冠心病的潜在作用。

在预测通路中，复方与IL-17通路及AGEs-RAGE通路关联度较大，现代临床认为IL-17信号通路在炎症反应中起到重要作用，IL-17细胞因子家族由IL-17a、IL-17b、IL-17c、IL-17d、IL-17e和IL-17f组成，在免疫反应中主要起到促进炎症反应的作用。现代临床实验发现，IL-17通路被激活后不仅直接加速心室重构的发展过程，还可以通过加速血管的动脉粥样硬化过程，增加左心室后负荷，从而加速心室重构过程。此外，该免疫通路激活后可以促进冠状动脉硬化发展过程，导致心肌缺血进一步加重，最终导致心室重构[32-36]。糖尿病是冠心病发病的重要危险因素，现代研究发现AGEs-RAGE信号通路与糖尿病发生发展息息相关：AGEs为晚期糖基化终产物(advanced glycation end products，AGEs)，其在血管壁损伤、炎症反应、氧化应激、动脉粥样硬化病变中都发挥重要作用，AGEs与其受体RAGE参与并介导氧化应激的多种信号通路促使活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成，激活核因子-κB，分泌大量炎性因子，导致血管内皮损伤和炎症反应，加速动脉粥样硬化斑块的发展[37-38]。

芪芍通脉汤中同一有效成分可调控不同靶点，同一靶点可与不同有效成分相对应，同时可参与不同信号通路及生物学过程，体现了该复方多成分、多靶点、多途径的特点。但本研究基于数据库挖掘，研究结果尚存在一定的局限性，后续应在此基础上进行筛选和体内外试验，从而进一步明确该复方的主要调控通路及生物学过程。