基于辐照场糖基化改性的大豆蛋白冻融稳定性提高研究

王喜波 王玉莹 周 淼 姜 朔 付 玲

(东北农业大学食品学院, 哈尔滨 150030)

0 引言

大豆分离蛋白是以低温脱脂豆粕为原料，经碱溶酸沉法制备的全价蛋白质[1]。大豆分离蛋白应用于食品中不仅能提高产品营养价值，还可以调节功能特性[2]。在运输储藏中，乳液食品通常需要冷藏或冷冻来保证品质[3]或延长保质期，但乳液体系经过冷冻后，经常会出现脂肪聚结、冰晶析出、奥氏熟化等不稳定的现象，严重破坏了乳液的结构，使食品品质发生劣变[4]。大豆分离蛋白常用作乳化剂以维持乳液食品体系的稳定。天然大豆蛋白结构较为致密，在食品体系中乳化功能较差，必须对其进行适度改性才能满足食品工业的要求。

美拉德反应是一种公认的蛋白质改性方法。糖的加入会改变蛋白的空间结构，使其柔性和疏水性增大，而复合物能迅速吸附至油水界面形成立体网络，增加界面膜的厚度，抵抗外界环境造成的干扰[5]。辐照作为一种新兴的冷处理方法，能够最大程度保证食物的原有风味，同时还具有低能耗、低成本等优点[6]。2003年国际食品法典委员会规定，在保证食品结构的完整性、功能性和安全性的情况下，辐照剂量可大于10 kGy，这给辐照技术应用于食品行业提供了保障[7]。研究表明，辐照通过改变蛋白分子的结构进而改变蛋白质的功能特性。辐照后蛋白质的结构改变导致性质发生变化，增加辐射剂量，大豆分离蛋白乳化性提高[8]，α-螺旋含量下降，荧光光谱出现蓝移[9]。经伽马射线辐照后，红豆分离蛋白蛋白质分子结构展开、疏水基团暴露，各种功能性质均有所改善，但辐照剂量进一步增加时，红豆蛋白分子发生聚集，部分功能特性下降[10]。

目前，利用辐照技术辅助糖基化改性大豆蛋白的研究鲜有报道。本文利用γ射线辐照处理大豆分离蛋白与麦芽糖混合物，使其发生美拉德反应，进而改善大豆蛋白质乳液体系的冻融稳定性，旨在建立Box-Behnken模型、优化出抗冻融大豆分离蛋白，以扩大大豆蛋白在食品中的应用范围。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

低温脱脂豆粕，山东禹王实业有限公司;麦芽糖，湖北信康药化有限公司;九三大豆油，黑龙江九三油脂有限责任公司;其他试剂均为分析纯。

FJ300S型数显高速分散均质机，上海隆拓仪器设备有限公司; 高压均质机，常州市超力均质泵厂; 高速冷冻离心机，广州吉迪仪器有限公司; 紫外可见分光光度计，菲勒仪器有限公司; 恒温磁力搅拌器，天津合普公司；MS104TS型分析天平，上海花潮实业有限公司；数显型恒温水浴锅，江苏盛蓝仪器制造有限公司；YS-100YS-100型生物显微镜，上海蔡康光学仪器有限公司；FTIR-1500型傅里叶变换红外光谱仪，天津港东科技股份有限公司；扫描电子显微镜，德国卡尔蔡司公司；FD系列冷冻干燥机，上海豫明仪器设备厂。

1.2 试验方法与指标测定

1.2.1大豆分离蛋白制备

根据文献[11]所述方法，略有改进。将经60目筛磨碎的低温脱脂豆粉与去离子水按料液比10 g/mL混匀2 h后调pH值至8.5，除去离心后的不溶物，用HCl调pH值至4.5，静置2 h后离心得沉淀。洗涤3次后用NaOH调pH值至7.0，冷冻干燥后得大豆分离蛋白。

1.2.2辐照糖基化大豆分离蛋白制备

将大豆分离蛋白(SPI)与麦芽糖(M)以一定质量比(3、4、5)溶解于磷酸盐缓冲溶液(0.01 mol/L、pH值7.0)中，充分混匀配制一定质量浓度(30、40、50 mg/mL)的溶液。静置12 h使其完全水化。取样品溶液置于60Coγ 辐射源下进行辐照反应(辐照剂量为5、7.5、10 kGy)。将辐照后样品冷冻干燥即得辐照SPI-M(辐照糖基化大豆分离蛋白)。

1.2.3接枝度

根据文献[12]所述方法，略有改进。将40 mg邻苯二甲醛溶于1 mL甲醇、25 mL的0.1 mol/L四硼酸钠后，分别加入2.5 mL质量分数为20%的SDS(十二烷基硫酸钠)和100 μL β-巯基乙醇，混匀后用超纯水定容至50 mL即为OPA试剂，OPA试剂现配现用。将4 mL OPA试剂与200 μL样品溶液混合放入35℃水浴锅中反应2 min后于340 nm处测吸光度，以去离子水作空白。接枝度计算公式为

(1)

式中A1——接枝反应前溶液吸光度

A2——接枝反应后溶液吸光度

1.2.4傅里叶红外光谱

根据文献[13]所述方法，略有改进。将样品粉末压制成薄片放于样品台的金刚石ATR(衰减全反射)附件上，调分辨率为4 cm-1，扫描次数8次，测量范围为4 000～400 cm-1。

1.2.5乳化性

根据文献[14]所述方法，略有改进。取30 mL 2 mg/mL样品溶液与10 mL大豆油以转速11 000 r/min均质1 min后，分别于0 min和10 min在底部取100 μL分散在10 mL的SDS中，于500 nm测吸光度。乳化活性指数和乳化稳定性指数计算公式为

(2)

式中A0——0 min时的吸光度

T——常数，取2.303

N——稀释倍数，取100

φ——体系中油相所占的体积分数，取25%

C——蛋白质的质量浓度，g/mL

L——比色池光径，cm

(3)

式中A10——10 min时的吸光度

ΔT——时间差，取10 min

1.2.6乳析指数

取90 mL样品溶液与10 mL大豆油以转速11 000 r/min均质3 min后再60 MPa高压均质形成微乳液。将乳液于-22℃冰箱中冷冻22 h后在水浴锅中解冻，进行3次冻融循环[15-16]。乳析指数计算公式为

(4)

式中HS——乳清层高度，cm

HT——乳液总高度，cm

1.2.7出油率

根据文献[17]所述方法，略有改进。将8 g样品乳液和2 g苏丹Ⅲ油溶液充分混合以10 000 r/min离心20 min后取上清液于508 nm测定吸光度，大豆油为空白。出油率计算公式为

(5)

式中m0——苏丹Ⅲ油溶液的质量，g

me——乳液的质量，g

a——离心前后苏丹Ⅲ油溶液吸光度比值

φd——乳液中油相质量分数，取20%

1.2.8扫描电镜观察分析

取一定量冻干后的样品，采用导电胶贴于载物台上，并使用离子溅射仪镀金。之后在S-3500N型扫描电子显微镜放大3 000倍下观察样品的微观形貌，加速电压为5 kV。

1.2.9光学显微镜观察分析

根据文献[18-19]所述方法，略有改进。将冻融后的样品乳液摇匀后取8 μL置于载玻片中，盖上盖玻片后置于显微镜的观察区，调整倍数为400倍来观察样品乳液微观状态。

1.2.10辐照SPI-M制备工艺优化

根据单因素试验的结果[20]，接枝度与第1次冻融后的乳析指数Pearson相关系数为-0.915，呈显著负相关，以其为响应值，以SPI与M质量比、SPI质量浓度和辐照剂量为变量，设计Box-Behnken试验方案，优化高冻融稳定性大豆蛋白制备工艺，因素编码见表1。

表1 Box-Behnken 试验因素与编码Tab.1 Box-Behnken experimental factors and codes

1.3 数据统计分析

所有试验均重复3次，采用SPSS 19.0软件进行试验数据分析。采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面分析，采用PeakFit 4.12软件对红外光谱进行拟合计算，采用OriginPro 8软件绘图。

2 结果与分析

2.1 响应面试验结果与分析

2.1.1试验结果

在前期单因素试验基础上[20]，对SPI与M质量比、SPI质量浓度和辐照剂量3个因素进行优化，以接枝度和第1次冻融后的乳析指数为响应值设计三因素三水平的响应分析试验，共17个试验点，其中12个为析因点，5个为零点，析因点为自变量取值在X1、X2、X3(SPI与M质量比、SPI质量浓度、辐照剂量的编码值)所构成的三维顶点，零点为区域的中心点，其中零点试验重复5次，以估计试验误差。结果如表2所示。

表2 Box-Behnken试验结果Tab.2 Experimental results of Box-Behnken experiment

2.1.2模型建立及显著性检验

采用Design-Expert 8.0.6软件对试验数据进行回归拟合，得到响应值对SPI与M质量比、SPI质量浓度和辐照剂量3个因素的回归方程为

表3 Box-Behnken 试验方差分析Tab.3 Variance and significant analysis of Box-Behnken design test

为了更合理表现各因素交互作用对大豆分离蛋白冻融特性的影响，对各因素与响应面值构成的三维空间响应面图进行分析。由图2知，当SPI与M质量比、SPI质量浓度和辐照剂量中的1个因素固定在0水平时，另外2个因素都对接枝度和乳析指数有交互影响。由图2a知，当辐照剂量一定时，随着SPI质量浓度的增加，辐照SPI-M的接枝度先上升后下降，可能是因为蛋白分子含量的增加，加大了与麦芽糖分子的碰撞几率，接枝程度增加，但蛋白含量过大导致反应体系黏度过大不利于发生美拉德反应[21]。当辐照剂量一定时，糖比例降低时，糖分子移动空间大，能迅速与蛋白分子发生接枝反应，接枝度增加，但糖进一步降低，不足以与蛋白质充分发生反应，接枝度下降[22]。同样，当SPI与M质量比和SPI质量浓度一定时，随着辐照剂量的增加，辐照SPI-M的接枝度依然呈现先上升后下降的趋势，可能是因为辐照处理打开了蛋白分子的结构，增加了与糖的结合机率[23]。接枝度和乳析指数呈负相关，接枝度越大乳析指数越小[24]。由图2b知，乳析指数随SPI质量浓度和辐照剂量的增加呈现先下降后上升的趋势，当SPI与M质量比减小的时候，也表现出了同样的变化。可能是辐照处理改变了蛋白质分子的结构，随着糖链的引入，增加了界面膜的机械强度，阻止了尖锐的冰晶对界面膜破坏，改善了冻融特性[25-26]。通过Design-Expert 8.0.6软件分析，预测在稳定状态下的最佳工艺条件为SPI与M质量比4.04、SPI质量浓度39.01 mg/mL、辐照剂量7.49 kGy。考虑到试验条件的可操作性，将优化的最佳条件修改为：SPI与M质量比4、SPI质量浓度40 mg/mL、辐照剂量7.5 kGy。在此条件下进行3次验证性试验，接枝度平均值为34.56%和第1次冻融后的乳析指数平均值为27.18%，模型预测值接枝度为34.55%和第1次冻融后的乳析指数为27.16%，证明本模型优化工艺参数可靠，具有实用价值。

图1 预测值和实测值的对照图Fig.1 Comparison of predicted and observed values

2.1.3响应面分析与优化

图2 各因素对大豆分离蛋白冻融特性的影响Fig.2 Effect of various factors on freeze-thaw properties of soy protein isolate

2.2 不同样品冻融特性分析

在冷冻和解冻处理之后，由于油相和水相之间的密度差异，乳剂显示出乳化或沉降现象，乳液中的不稳定性主要归因于冷冻过程中冰晶形成的不稳定效应[3]。本试验设定了SPI和SPI+M(无辐照)2个对照组，分析进行3次冻融循环后样品的冻融特性。由表4可知，经过冻融循环后，样品乳液的乳析指数显著增加，尤其是SPI。单纯添加麦芽糖的SPI+M对比SPI冻融特性虽有改善，但效果不明显。而辐照SPI-M在经历冻融循环后，乳析指数相对稳定，表现出较好的冻融特性。对比SPI，乳析指数分别降低了22.98、28.40、30.70个百分点。可能是因为辐照打开了蛋白分子的结构，释放了更多的游离氨基，增加了与糖分子的碰撞机会，引入的糖链在界面膜附近形成立体网络，增加了界面膜的厚度，抵抗形成的冰晶对界面膜的破坏，防止液滴间的聚集，其冻融稳定性显著提高[23,27]。文献[28]的研究表明，多糖可以吸附到蛋白质层形成较厚的界面膜，增加乳液的稳定性。

表4 SPI、SPI+M及辐照SPI-M乳析指数分析Tab.4 SPI, SPI+M and irradiated SPI-M creaming index analysis %

表5为SPI、SPI+M及辐照SPI-M的乳化性和经历冻融后的出油率变化。由表5可知，辐照SPI-M乳化活性和乳化稳定性比SPI和SPI+M要好，而SPI和SPI+M乳化性相差不大，说明单纯的添加糖并不会对乳化性有所改变。文献[29]也表明蛋白质-糖缀合物的乳化性能优于蛋白质和糖的混合物。辐照SPI-M的乳化活性指数和乳化稳定性指数对比SPI分别提高了9.26 m2/g和3.76 min。可能是因为辐照处理引入糖链，溶解性增加，进而提高了乳化性[22]。出油率是表征冻融特性的重要指标之一，出油率越低，乳液越稳定[30]。可从表5明显看出，历经冻融循环后，SPI和SPI+M出油率急剧增加，SPI+M比SPI虽有降低，但总体改善不大。辐照SPI-M具有较低出油率，与SPI相比，出油率分别降低了9.7、21.2、26.4个百分点。可能是因为乳化性增加，减少了油滴的碰撞，稳定了乳液[31]。

表5 SPI、SPI+M及辐照SPI-M乳化性和出油率分析Tab.5 Analysis of emulsification and oiling off of SPI, SPI+M and irradiated SPI-M

2.3 红外光谱分析

红外光谱是分析糖是否与蛋白质共价相连的重要手段之一，光谱图吸收峰的变化与样品各基团的改变相对应。红外光谱图上—OH基团在3 700～3 200 cm-1处出现较宽的伸缩振动峰，C—N键在1 260～1 000 cm-1处出现较强的振动[32-33]。由图3可知，与SPI对比，辐照SPI-M在1 260～1 000 cm-1范围内出现了较强的振动，新吸收峰出现，说明C—N键的数量增加，新生成了C—N基团，证明大豆分离蛋白与麦芽糖是以共价键的方式结合[34]。文献[35]通过超声波和微波辅助糖基化制备大豆分离蛋白-葡聚糖缀合物，傅里叶变换红外分析证明大豆分离蛋白和葡聚糖通过美拉德反应形成了共价键。与SPI对比，辐照SPI-M在3 700～3 200 cm-1处出现了较宽的吸收峰，是由—OH的伸缩振动引起的，表明大豆分离蛋白与麦芽糖发生美拉德反应后，糖分子的接入使辐照SPI-M的亲水性羟基数量增加。SPI+M混合物的红外光谱中并未在3 700～3 200 cm-1处出现较宽的吸收峰，表明单纯的混合糖后，SPI结构并未产生新的基团。

图3 SPI、SPI+M及辐照SPI-M红外光谱图Fig.3 SPI, SPI+M and irradiated SPI-M infrared spectroscopy

2.4 扫描电镜分析

蛋白质的微观结构变化影响其功能性质，扫描电镜图像可以提供样品精细的表面形貌。图4为冻干后未经处理的SPI和辐照SPI-M的放大3 000倍的微观结构图。从图中可见辐照处理前后大豆分离蛋白的微观结构具有明显的区别。大豆分离蛋白在未处理之前表面平滑，而辐照SPI-M表现为出现细小空隙的凹洞，呈蜂窝状，形成疏松孔洞，呈现出良好的持水性。文献[36]也支持本文假设，即均匀的网状空间结构有利于吸水能力的提高。文献[37]表明大豆分离蛋白与葡聚糖紧密结合，得出了与本文相似的结果。

图4 SPI及辐照SPI-M微观结构Fig.4 SPI and irradiation SPI-M microstructure

2.5 光学显微镜分析

图5为SPI及辐照SPI-M乳液冻融前后的光学显微结构，由图5可知，SPI和辐照SPI-M初始乳液并没有出现明显区别，但经过冷冻处理后，可明显看出SPI出现许多较大油滴和团块，可能是因为冷冻后，乳液中水分遇低温体积变大，形成尖锐的冰晶刺破界面膜，油滴渗透聚集形成大油滴[38]。而辐照SPI-M只出现部分小油滴，乳液性质稳定。文献[35,39]的研究结果也表明糖基化改性产物在冻融后表现出相对稳定的状态。

图5 SPI及辐照SPI-M乳液冻融前后的光学显微结构Fig.5 Optical microstructures of SPI and irradiated SPI-M emulsion before and after freeze-thaw

3 结束语

利用Design-Expert 8.0.6软件设计建立Box-Behnken模型，对辐照场下糖基化改性制备高冻融稳定性大豆蛋白工艺进行了优化，得出最佳制备条件为：SPI与M质量比4、SPI质量浓度40 mg/mL、辐照剂量7.5 kGy。在此条件下得到的改性SPI与对照SPI相比，乳析指数分别降低了22.98、28.40、30.70个百分点，出油率分别降低了9.7、21.2、26.4个百分点。乳化活性指数和乳化稳定性指数对比SPI分别提高了9.26 m2/g和3.76 min。说明该模型合理、可靠，能够改善大豆分离蛋白的冻融性。红外光谱表明，大豆分离蛋白与麦芽糖发生美拉德反应。扫面电镜表明，辐照SPI-M呈蜂窝状，具有良好的持水性。光学显微镜分析表明，在冷冻和解冻处理之后，辐照SPI-M乳液更稳定。说明采用辐照处理能使大豆分离蛋白与麦芽糖发生美拉德反应，并改善大豆分离蛋白冻融特性。