萝卜籽油中莱菔素的检测及加工工艺对莱菔素含量的影响

李楠楠，韩立娟,2,，张维农,2，齐玉堂,2，贺军波,2，王青松，刘 琛

（1.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023；2.农产品加工与转化湖北省重点实验室，湖北 武汉 430000）

近年来，全球癌症死亡率呈上升趋势，与常规放疗和化疗相比，天然抗肿瘤药物具有较低的副作用效果[1]，研究表明，食用十字花科蔬菜（如花椰菜、卷心菜、萝卜）可以降低患某些癌症的风险，这种功效与十字花科蔬菜中含有的芥子油苷的某些水解产物有关[2-3]。芥子油苷是十字花科蔬菜中富含硫的次生代谢产物[4]，不具有生物活性[5]，但在组织被破坏后，与内源性黑芥子酶接触时，就会发生酶水解生成相应的水解产物异硫氰酸盐[6-7]，反应过程如图1所示[8]。研究表明，萝卜籽中含有大量的异硫氰酸盐，其中莱菔素（sulforaphene，SFE）占比最高，占总异硫氰酸盐的60%以上[9]，具有抗癌、抗菌、抗氧化等特性[10]。SFE是一种小分子化合物，与花椰菜中富含的莱菔硫烷（sulforaphane，SFA）相比，SFE在烃基链上比SFA多了一个不饱和双键，造成SFE的生物活性比SFA高了1.3～1.5 倍[11]，但SFE非常不稳定，在水、碱性条件和高温下都容易发生降解，但对光照较为稳定[12]。—OH和OH－可以进攻SFE—N＝C＝S中的活泼碳原子，生成一种二聚物从而降解[13]，另外，OH－也可能与SFE分子中的亚砜基团反应生成—CH3SOOH而引起降解[14]。由于SFE的不稳定性使它的提取和应用受到很大限制。

图1 芥子油苷酶解反应方程式Fig.1 The reaction equation of glucosinolates

油用萝卜籽一般含油量为30%～50%[15]，油中不饱和脂肪酸占80%以上，以油酸、芥酸、亚油酸为主[16]，有利于改善便秘，促进小肠蠕动[17]，具有很强的保健功能[18]，使其享有“东方橄榄油”的美誉。目前制取萝卜籽毛油一般采用冷榨法、超临界CO2萃取法和溶剂浸出法等[19]。冷榨萝卜籽油毛油常采用低温水化、低温干燥进行精制，能够最大程度地保留冷榨油的风味[8]。但压榨法的出油率比较低，且油中SFE含量不高[20]。阮丽红[21]和张杰[22]等采用超临界CO2萃取萝卜籽毛油，发现萃取时间短、油脂得率高，但并未测定毛油中SFE含量，且该方法成本相对较高。高文庚等[23]对比了无水乙醚、石油醚、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯分别作为浸出溶剂时萝卜籽毛油的提取率，发现用二氯甲烷浸出时，提取率为34.47%，SFE含量（占毛油质量）为89.5 mg/kg。赵功玲等[11]采用水泡、酶解、二氯甲烷提取的方法，比较了整粒浸泡酶解、种子粉碎酶解、种子粉碎3 种预处理方法对提取的萝卜籽油中多种指标的影响，发现整粒浸泡酶解法提取萝卜籽毛油的中SFE含量为85.34 mg/kg[24]，8 种萝卜籽毛油中SFE含量范围为28.39～114.73 mg/kg。

现有报道检测油中SFE含量均参考检测萝卜新鲜组织中SFE含量的方法[25-27]，鲜有文献报道萝卜籽毛油中SFE含量检测的具体前处理方法[11,23-24]，所以首先应建立合适的萝卜籽毛油中SFE的检测前处理方法。在现有的萝卜籽加工工艺中，采用水泡和长时间酶解等预处理方式会造成SFE的降解，而且重点考察的是油脂的提取率和脂肪酸含量，鲜少考虑对预处理方式的改进以提高毛油中的SFE含量，以及制取毛油后的精制或精炼过程对SFE的影响。且由于SFE的不稳定性，即使得到了富含SFE的毛油，如何做到精炼过程中SFE的高保留更为重要。因此，本研究首先通过对萝卜籽毛油的样品前处理萃取方式的优化和加标回收实验，确定萝卜籽油中SFE含量的检测方法，然后对比不同预处理对SFE生成量的影响，以萝卜籽毛油中SFE含量为评价指标对浸出溶剂进行筛选，最后分析精炼工艺对SFE含量的影响规律，旨在为萝卜籽油的加工和开发利用提供更多的指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

萝卜籽 武汉市蔬菜科学研究所；SFE标准品加拿大Toronto Research Chemicals公司；脱磷剂（主要成分为膨润土、柠檬酸、助滤剂）、脱酸剂 武汉金鸿鑫生物科技有限公司；正己烷、乙醚、丙酮、二氯甲烷、甲醇（均为分析纯），乙腈（色谱纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

AR2140电子分析天平 奥斯豪仪器（上海）有限公司；HD-809多功能电蒸笼 中山市东凤镇汉瑞电器厂；RE52C5旋转蒸发仪、SHZ-D循环水真空泵 上海市亚荣生化仪器厂；7890A气相色谱仪 安捷伦科技有限公司；GZX-9130ME数显鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；KW-1000DC水浴恒温振荡器江苏金坛亿通电子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 萝卜籽毛油中SFE的气相色谱检测[28]

色谱柱：HP-5弹性石英毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；气化室温度和检测器温度均为280 ℃；采用氢火焰离子检测器；恒流流速1.0 mL/min；分流比10∶1。升温程序：80 ℃保持1 min，以20 ℃/min升到150 ℃，再以40 ℃/min升到280 ℃，保持3 min。

1.3.2 SFE标准曲线的绘制

将适量SFE标准品溶于乙腈，配制质量浓度为10.0 mg/mL的SFE标准储备液，分别将其稀释至1.0、0.5、0.2、0.1、0.05 mg/mL。将配制好的SFE标准溶液按1.3.1节气相色谱法进行检测，并记录相应的峰面积，以SFE进样质量浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。线性回归方程为y=707.93x－38.494（R2=0.998 1），本方法的检出限和定量限分别为0.25 μg/mL及1.00 μg/mL，即在质量浓度为0.05～1.0 mg/mL区间内，线性关系良好。

1.3.3 萝卜籽毛油的样品前处理萃取方式优化

分别用有机溶剂甲醇、乙腈进行直接萃取和依次用水、二氯甲烷进行两步萃取的方式萃取萝卜籽毛油中的SFE，按照1.3.1节进行气相色谱分析。

甲醇、乙腈直接萃取法：取5 g萝卜籽毛油，按体积比1∶1加入甲醇或乙腈，25 ℃恒温振荡萃取30 min，3 000 r/min离心3 min，分层取有机相，35 ℃旋转蒸发去除甲醇或者乙腈，用乙腈定容。

两步萃取法：取5 g萝卜籽毛油，按体积比1∶1加入蒸馏水，25 ℃恒温振荡10 min后，3 000 r/min离心3 min，取水层，待用。按体积比1∶1加入二氯甲烷，25 ℃恒温振荡萃取30 min，3 000 r/min离心3 min，分层取有机相，35 ℃旋转蒸发去除二氯甲烷，用乙腈定容。

1.3.4 加标回收实验

取5 g萝卜籽毛油，分别添加质量浓度依次为0、0.5 mg/mL和1.0 mg/mL的SFE标准溶液并使其充分混合，然后按照1.3.4节中两步萃取的方法进行处理并测定，根据目标峰的峰面积和标准曲线计算出样品实际质量浓度和样品的加标回收率。

1.3.5 萝卜籽水分调节方式的选择

将初始水分质量分数为4%的萝卜籽进行粉碎，喷水调节水分质量分数达到8%，取3 等份分别进行以下处理：其中一份经酶解后直接提取毛油；另一份在4 ℃平衡水分10 h后，再经酶解；第3份放置于多功能蒸笼上蒸制3 min后取下，再经酶解。酶解条件为50 ℃、3 h。索氏抽提法用乙醚抽提8 h提取萝卜籽毛油，分别测定毛油中SFE含量。按照1.3.3节进行两步萃取法处理和1.3.1节气相色谱分析。

1.3.6 预处理粉碎对SFE生成量的影响

取3 等份初始水分质量分数为4%的萝卜籽，一份整粒喷水调节水分质量分数达到8%；另一份先粉碎后再喷水调节水分质量分数达到8%；第3份作为对照样，只粉碎，不调节水分。将3 份萝卜籽分别密封，50 ℃酶解3 h。索氏抽提法用乙醚抽提8 h提取萝卜籽毛油，测定毛油中SFE含量。按照1.3.3节进行两步萃取法处理和1.3.1节气相色谱分析。

1.3.7 浸出溶剂的选择

将萝卜籽粉碎后喷水，调节水分质量分数达到8%，25 ℃密封酶解10 min，以料液比1∶3（g/mL）分别加入正己烷、乙醚、二氯甲烷和丙酮[23-24]，45 ℃搅拌1 h，然后抽滤，重复2 次，将滤液合并，35 ℃旋转蒸发去除溶剂，即得到4 份浸出毛油，以提取率和毛油中SFE含量为评价指标，筛选出最佳的浸出溶剂。按照1.3.3节进行两步萃取法处理和1.3.1节气相色谱分析。按下式计算提取率：

1.3.8 萝卜籽毛油精炼工艺

按照1.3.7节方法，用丙酮浸出得到萝卜籽毛油。

常规精炼：按照已有报道[29]的方法对毛油分别进行水化脱胶、碱炼脱酸、吸附脱色、真空脱臭，得到对应的脱胶油、脱酸油、脱色油、脱臭油，分别测定对应油中的SFE含量和其他理化指标。

无水常温精炼：称取一定质量的毛油，85 ℃真空干燥10 min，然后分次缓慢加入油质量2%的脱磷剂，搅拌15 min后过滤，向清油中加入油质量3%的脱酸剂，200 r/min搅拌2.5 h后离心，取上层清油，再加入油质量2%的脱色剂（活性白土与白炭黑质量比为1∶0.5），100 ℃真空搅拌30 min后过滤[30]，然后加入油质量5%的无水硫酸钠静置，真空抽滤，即为经过无水常温精炼处理的萝卜籽油，最后对无水常温精炼油中SFE含量和其他理化指标进行测定。

1.3.9 萝卜籽油的理化指标测定

水分及挥发物含量：按照GB 5009.236—2016《动植物油脂水分及挥发物测定电热干燥箱法》测定；色泽：按照GB/T 22460—2008《动植物油脂罗维朋色泽的测定》测定；磷脂含量：按照GB/T 5537—2008《粮油检验 磷脂含量的测定》重量法测定；酸价：按照GB 5009.229—2016《食品中酸价的测定》冷溶剂指示剂滴定法测定，以KOH计；过氧化值：按照GB 5009.227—2016《食品中过氧化值的测定》滴定法测定。

1.4 数据处理

采用Excel对平均值、标准差等数值进行计算以及绘制图表，使用Origin 8.5软件进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 萝卜籽毛油样品前处理萃取方式优化

图2 有机溶剂直接萃取和经过两步萃取油中SFE气相色谱检测结果Fig.2 GC profiles of SFE in oils obtained by direct extraction with organic solvents and two-step extraction

采用气相色谱仪检测萝卜籽油中的SFE，若直接进样，因脂肪酸的沸点太高，而使得分离困难，且干扰峰太多。此外，SFE的热稳定性差，所以甲酯化并不适合样品的前处理。考虑到SFE易溶于极性较大的有机溶剂，本实验分别选取了甲醇和乙腈2 种与油脂互溶性差，而与SFE有很好互溶性的有机溶剂从油中一步萃取SFE。如图2所示，箭头所示即为目标峰，显然2 种有机溶剂除SFE以外，还同时从油脂中萃取了其他物质，导致色谱图中杂峰较多，目标峰响应值低，且峰形很差。

考虑到SFE有一定的极性，在油水两相共存时，更易溶于水，且油中能溶于水的物质较少，所以第1步先用水萃取油中的SFE，第2步再用二氯甲烷进行萃取，最后经气相色谱进行检测，结果如图2c所示。经过上述两步萃取后，目标峰（图中箭头所指）清晰，且附近没有杂峰干扰，峰形好，响应值高，检测效果较好。

2.2 加标回收实验结果

表1 加标回收实验结果Table 1 Results of spiked recovery experiments

为考察两步萃取的效果，在萃取前添加2 种质量浓度不同的SFE标准溶液，并做空白对照，按照前述方法处理后，进行气相色谱检测，通过峰面积和拟合的标准方程计算实际浓度，然后计算出样品的加标回收率，结果如表1所示。加标回收率在78.84%～99.70%之间，相对标准偏差（relative standard deviations，RSD）均低于1.52%，且最低RSD仅为0.21%。表明该方法具有令人满意的回收率和重复性，满足分析的要求。

采用气相色谱对萝卜籽毛油中SFE进行定量检测。采用两步萃取方式检测萝卜籽毛油中SFE，最终确定的前处理方式为5 g萝卜籽毛油加入5 mL蒸馏水，25 ℃振荡10 min，取水层，然后按体积比1∶1加入二氯甲烷，25 ℃恒温萃取30 min，然后利用气相色谱外标法定量。回收率和重复性较好，表明本样品前处理方式可以用于定量检测萝卜籽毛油中的SFE。

2.3 预处理对SFE生成量的影响

2.3.1 水分调节方式的选择

表2 不同水分调节方式得到毛油中SFE含量Tabel 2 Effects of different water adjustment methods on sulforaphene content in crude oil

从表2可以看出，喷洒后平衡10 h和直接喷洒2 种水分调节方式对萝卜籽毛油中SFE含量影响差别不大，表明无需等待水分平衡，即可完全渗透，完成酶解反应。而经过高温蒸汽处理后得到的毛油中SFE含量为0，这极有可能是因为黑芥子酶是十字花科植物中的内源酶，其活性跟植物种类、品种和不同的部位有关，可能是高温蒸汽破坏了萝卜籽中的黑芥子酶，使其失活[31]，导致无法产生SFE，也可能是由于SFE在高温下挥发，从而无法从油中检测到SFE。从时效性考虑，最佳的水分调节方式为直接喷洒。

2.3.2 粉碎对SFE含量的影响

表3 粉碎对毛油中SFE含量的影响Table 3 Effects of crushing on sulforaphene content in crude oil

从表3可以看出，萝卜籽经过粉碎再调节水分所得到的毛油中SFE含量最高，而整粒调节水分的毛油中SFE含量低了一半，不做处理的对照样中未能检测到。这是因为粉碎严重破坏了萝卜籽细胞的细胞壁，经水分调节后，酶能与底物充分接触，从而提高SFE含量。整个酶促反应中需要水的参与，故而只经过粉碎未调节水分的对照样中未能检测到SFE。而赵功玲等[24]在研究中发现萝卜籽整粒调质（相当于固液比1∶2）酶解法得到的萝卜籽毛油中SFE含量最高，与本实验结果不相符，可能原因是其预处理工艺中浸泡时间过长，SFE发生降解或挥发，导致粉碎加水酶解法处理过的萝卜籽毛油中SFE含量较整粒酶解法的低。

2.3.3 酶解时间对SFE生成量的影响

图3 酶解时间对萝卜籽中SFE生成量的影响Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on sulforaphene production in radish seeds

从表2、3可知，在萝卜籽的前处理过程中，先将萝卜籽粉碎，后喷水调质得到的萝卜籽毛油中SFE含量最高。SFE的生成过程为内源酶黑芥子酶的酶解过程[6]，酶与底物接触时间短，萝卜籽中的芥子油苷未水解完全，使得产生的SFE量少，接触的时间过长，反应提前结束，同时由于SFE的不稳定性[12]，导致生成的SFE不能很好保留，最终造成SFE的净含量降低，所以酶解时间至关重要。本实验首先固定酶解温度为25 ℃，增湿比例（添加水分质量/萝卜籽质量）为20%，改变酶解时间0～40 min（以10 min为间隔），结果如图3所示。随着酶解时间的延长，萝卜籽中SFE生成量逐渐增加，在10 min左右达到最大值，随后急剧下降。这是因为在酶解的过程中，SFE既在产生，又同时在分解，其含量处于一个动态过程，当生成量大于分解量时，宏观上就表现为增加，当生成量小于分解量时，宏观上表现为减少。在酶解时间为0 min时，萝卜籽SFE生成量也达到了较高值，这是因为在进行酶解前的喷水调节水分，再用乙腈萃取的过程中，也产生了SFE。故确定最佳酶解时间为10 min。

2.3.4 酶解温度对SFE生成量的影响

SFE得率与黑芥子酶的活性有关，温度是影响酶活力的重要因素[32]，同时温度还会影响SFE的热稳定性。在最佳酶解时间10 min条件下，确定增湿比例为20%，改变酶解温度为5～45 ℃（以10 ℃为间隔），结果如图4所示。在25 ℃时，萝卜籽中SFE含量达到最大值，这与黑芥子酶的最适温度有关。Shen Lianqing等[33]在研究中发现，黑芥子酶在25 ℃时，酶活力达到最大，这与本实验结果相符。同时SFE的热稳定极差，高温时容易分解，因此，酶解温度为25 ℃时，SFE生成量达到最高，是酶解的最适温度。

图4 酶解温度对萝卜籽中SFE生成量的影响Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on sulforaphene production in radish seeds

2.3.5 增湿比例对SFE生成量的影响

图5 增湿比例对萝卜籽中SFE生成量的影响Fig.5 Effect of humidification ratio on sulforaphene production in radish seeds

在萝卜苷酶解反应过程中，水充当着重要的角色，既作为反应的参与者，又作为SFE的良好溶剂，萝卜籽水分含量直接影响SFE生成量[7]。以增湿比例为影响因素，在酶解温度25 ℃、酶解时间10 min条件下，改变增湿比例为0%～40%（以10%为间隔），结果如图5所示。随着增湿比例的增加，萝卜籽中SFE生成量呈现出急剧上升的趋势。实际生产过程中可以根据不同的目的选择合适的增湿比例，当仅以大量生产SFE为目标时，可以选择较大的增湿比例；水分含量高时不能作为油料进行浸出提油，则应选用较小的增湿比例，将萝卜籽水分质量分数调质到8%，即增湿比例为3.6%。

综上所述，当萝卜籽作为油料开发利用，用溶剂浸出法制取萝卜籽油时，最佳的预处理工艺为酶解温度25 ℃、酶解时间10 min、增湿比例3.6%。

2.4 浸出溶剂对毛油中SFE含量的影响

表4 不同溶剂得到浸出毛油中SFE含量Table 4 Sulforaphene contents in crude oils extracted with different organic solvents

从表4可以看出，用丙酮、二氯甲烷、乙醚和正己烷4 种不同极性的溶剂进行浸出取油时，油脂提取率的差别在4%以内，但是SFE含量差超过70 mg/kg。其中极性最强的是丙酮，其相应的浸出毛油中SFE含量也最高，达到了832.36 mg/kg；而极性最弱的正己烷，其相应的浸出毛油中几乎不含SFE。这可能是因为SFE属于弱极性物质[21]，在选取的4 种溶剂中，相比于其他3 种溶剂，丙酮与SFE的极性更接近一些，所以SFE在丙酮浸出过程中会随着油脂大量溶出，脱溶后留在毛油中。这一结果在萝卜籽的浸出溶剂选择上具有一定的指导作用，选择与油脂互溶性好的非质子溶剂更适合生产富含SFE的萝卜籽油。但应注意不能选择强极性的乙醇等作为浸出溶剂，因为醇羟基中的氧原子会进攻SFE的活泼碳原子，造成SFE的降解[34]。

2.5 常规精炼与无水常温精炼得到的萝卜籽油对比分析

表5 常规精炼与无水常温精炼工艺不同阶段萝卜籽油中SFE含量和基本理化指标Table 5 Sulforaphene contents and physicochemical indexes of radish seed oil at different stages of conventional refining and anhydrous room temperature refining

植物油毛油中一般都含有磷脂、蛋白质和糖类等胶溶性杂质，其中以磷脂含量居多[35]。由于磷脂具有吸湿和吸水膨胀性，吸水膨胀后形成乳浊的胶体溶液，进而可以采用离心的方法将其从毛油中分离出来。常规精炼一般均采用这种水化方式脱除磷脂等杂质。由表5可以看出，通过常规的水化脱胶、碱炼脱酸、吸附脱色、真空脱臭工序后得到的萝卜籽油均未检测到SFE，这与SFE的稳定性和精炼条件有关。SFE的热稳定性差，在水、高pH值的环境中易分解，而精炼过程一般都伴随高温、水、强碱等过程[36]。故常规精炼方法不适合保留萝卜籽油中的SFE，需要寻找一种更适宜萝卜籽毛油的精炼方法，使其满足食用油质量标准的同时，又能保证SFE的高保留率[37]。

要保证SFE的高保留，就要在精炼过程中避免高温、水、强碱等。本实验室提出了一种无水常温精炼法，即不加水不加热的一种温和精炼方法，最终得到的成品油中SFE含量为760.35 mg/kg，保留率高达91.3%。无水常温精炼成品油中磷脂含量比毛油略有降低，这是由于使用的脱磷剂虽然对油中的磷脂、蛋白质等物质存在一定的吸附作用，但脱除效果不如常规的水化脱胶。从水分及挥发物上来看，常规精炼脱胶阶段由于水分的加入引起水分及挥发物含量略有升高，其余阶段水分及挥发物含量不断降低，将有利于油脂的保存以及SFE的保留，无水常温精炼工艺中真空干燥以及无水硫酸钠也都起到了良好的脱水效果。

从表5可以看出，采用无水常温精炼工艺，经过脱酸剂处理后油的酸价显著降低，为0.58 mg/g，略高于常规碱炼脱酸工艺。但由于目前尚无萝卜籽油国家质量标准，因此，参照同属于十字花科的菜籽油的国家标准，发现可达到三级菜籽油的酸价要求（≤1.0 mg/g）。无水常温精炼油的色泽较毛油有明显降低，与脱胶油相近，但比常规脱色油R值高。这是由于脱色在常温下进行，使其脱色效果不如常规精炼脱色时的高温脱色。过氧化值是植物油脂的卫生监测指标，用于判断油脂是否酸败以及酸败程度[38]。由表5可知，采用丙酮浸出制备的萝卜籽毛油经过无水常温精炼工艺或者常规精炼的过氧化值均远低于国家食用油标准。

3 结 论

分别用甲醇、乙腈进行直接萃取和用水、二氯甲烷进行两步萃取的方法萃取萝卜籽毛油中的SFE，最终确定两步萃取方式更适合作为萝卜籽油中SFE含量的最佳检测前处理方法。通过不同的预处理，得到的萝卜籽毛油中SFE含量不同，从时效性考虑，最佳的预处理工艺为先将萝卜籽进行粉碎，直接喷洒调节水分质量分数到8%，25 ℃酶解10 min。对比丙酮、二氯甲烷、乙醚和正己烷4 种浸出溶剂制取萝卜籽毛油，油脂提取率差值在4%以内，但是SFE含量差值超过70 mg/kg，用丙酮浸出制取的毛油中SFE含量最高，达到了832.36 mg/kg。对毛油采用常规精炼时，第1步水化脱胶后油中的SFE就已完全损失。而采用无水常温精炼工艺得到的萝卜籽油，其基本指标均可达到国家三级食用油标准。同时，无水常温精炼萝卜籽油中SFE含量为760.35 mg/kg，保留率高达91.3%。对比2 种精炼工艺，后者的工序得到简化，SFE保留率高，品质达到了国标三级食用油标准，因此更适合作为萝卜籽油的精炼工艺。在萝卜籽油的加工过程中，应尽量避免油中SFE的损失，从而获得高营养价值的萝卜籽油。