六堡茶挥发性成分中关键香气成分分析

马士成，王梦琪，刘春梅，马婉君，朱 荫，林 智,，吕海鹏,

（1.梧州市茶产业发展服务中心，广西 梧州 543000；2.农业农村部茶树生物学与资源利用重点实验室，中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州 310008；3.中国农业科学院研究生院，北京 100081；4.广西梧州六堡茶股份有限公司，广西 梧州 543000）

六堡茶属于黑茶类，生产和饮用历史悠久，是我国传统历史名茶之一，原产于广西壮族自治区梧州市苍梧县六堡镇。经过近10年来的快速发展，产业规模不断壮大。据报道，2018年，六堡茶产量1.52万 t，产业直接产值达19亿 元，综合产值55亿 元[1]；六堡茶区域公用品牌价值达20.17亿 元，居中国茶叶区域公用品牌价值第29位[2]。六堡茶是选用苍梧县群体种、大中叶种及其分离、选育的品种、品系茶树（Camellia sinensis(L.) O.Kuntze）的鲜叶为原料，经杀青、初揉、堆闷、复揉、干燥工艺制成毛茶，再经过筛选、拼配、汽蒸或不汽蒸、渥堆、汽蒸、压制成型或不压制成型、陈化、成品包装等工艺过程加工制成的具有独特品质特征的黑茶[3]。六堡茶素以“红、浓、陈、醇”为其主要的品质特征，尤其是其“陈香”纯正的香气品质，受到越来越多消费者的喜爱。

香气是决定茶叶品质最重要的因子之一，茶香实质上是不同芳香物质以不同的浓度组合，并对嗅觉神经综合作用所形成的茶叶特有香型[4]。随着消费者对六堡茶香气品质的关注，科研工作者已经对六堡茶的香气成分开展较多研究，主要采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）联用技术和同时蒸馏萃取-GC-MS等分析技术手段，从六堡茶中鉴定出了大量的挥发性成分[5-9]，并发现芳樟醇、α-雪松醇、α-萜品醇、β-紫罗兰酮、1,2,3-三甲氧基苯、1,2,3-三甲氧基-5-甲基苯、4-乙基-1,2-二甲氧基苯、己醛、苯甲醛、苯乙醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、二氢猕猴桃内酯、水杨酸甲酯、柠檬烯等成分在六堡茶中含量丰富。然而，并非所有挥发性香气化合物都对茶叶香气品质具有贡献作用，而是存在一些对呈香起到重要作用的关键香气成分，一般是具有高香气强度值、高香气活度值的香气化合物[10]。尽管现有研究基本查明了六堡茶香气成分的总体组成情况，但并非所有挥发性香气化合物都对六堡茶的“陈香”香气品质具有贡献作用。因此，现有研究尚未揭示决定六堡茶“陈香”的关键香气化合物，由此限制了人们对六堡茶香气品质的深入探索。

目前，茶叶中关键香气化合物的鉴定和判别主要采用香气活性值（odor activity value，OAV）法和气相色谱在线嗅闻（gas chromatography-olfactometry，GC-O）法等开展。HS-SPME是一种无溶剂的样品处理技术，具有灵敏度高、操作简单、方便快捷的特点，能较准确地反映样品的风味组成，并能方便地与GC联用，已广泛用于茶叶香气成分的研究。鉴于挥发性成分数量繁多，各个成分的绝对定量难度很大，目前在HS-SPME-GC-MS分析的基础上可通过相对气味活性值（relative odor activity value，ROAV）评价不同组分对整体风味的贡献[11-13]。此外，GC-O直接强度法是通过嗅闻人员使用可变电阻器的移动记录气味随时间变化的强度，是一种判别关键香气成分的有效方法；例如，采用HS-SPME-GC-MS技术结合GC-O法分析表明，1,2,3-三甲氧基苯、1,2,4-三甲氧基苯等成分是普洱茶中的关键香气化合物成分[14]。

为了揭示决定六堡茶“陈香”香气品质的关键香气成分，本研究拟首先通过感官审评，选择一批在香气品质上具有“陈香”的代表性六堡茶样品为研究对象；继而采HS-SPME-GC-MS分析技术研究六堡茶香气成分组成，并结合ROAV计算和GC-O-MS分析等研究决定六堡茶“陈香”的关键香气成分，以期为六堡茶“陈香”香气品质的科学评价和深入探索提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

15 个六堡茶样品，由广西梧州六堡茶股份有限公司提供。根据研究分析需要，委托农业农村部茶叶质量监督检验测试中心对这批样品进行感官审评（密码审评），从中筛选出了10 个在香气品质上具有较好“陈香”品质的代表性六堡茶样品，且得分都在87 分以上。此外，根据香气感官审评结果，选取1 个香气品质最具代表性的样品（香气描述为“陈香显”，90 分）进行后续的GC-O-MS分析。

1.2 仪器与设备

HH-2数显恒温水浴锅 宁波江南仪器厂；自制改良萃取瓶（250 mL）、手动SPME进样器、65 μm PDMS/DVB固相微萃取头 美国Supelco公司；6890N-5973 GC-MS联用仪、DB-5MS色谱柱（30 m×250 μm，0.25 μm） 美国Agilent公司；PL202-L-电子天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HS-SPME-GC-MS分析

分别准确称取六堡茶样品各10.00 g，加入自制的250 mL改良萃取瓶，用100 ℃开水冲泡，茶水比为1∶3（g/mL），四氟乙烯密闭瓶口后，立即放入60 ℃水浴锅平衡5 min，后插入装有65 μm PDMS/DVB萃取头（实验前先将此萃取头在GC-MS进样口老化5 min）的手动进样器在水浴条件下顶空萃取，萃取时间60 min，取出后立即插入色谱仪进样口中，解吸附3.5 min，同时启动仪器收集数据。

GC条件：DB-5MS色谱柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；进样口温度250 ℃；载气：氦气（99.999%），流速1.6 mL/min；升温程序：由50 ℃保持3.0 min，以4.0 ℃/min升至265 ℃，保持5 min；传输线温度270 ℃；进样口温度280 ℃。

MS条件：电子电离源；电子能量－70 eV；质量扫描范围33～600 u；离子源温度220 ℃。

由GC-MS分析得到的质谱数据经计算机在NIST98.L标准谱库的检索，查对有关质谱资料，对基峰、质核比和相对丰度等方面进行分析，分别对各峰所代表的香气化合物结构及名称加以确认，以各香气组分的峰面积占总峰面积之比值表示组分相对含量。

1.3.2 基于ROAV分析的主体挥发性风味物质评定

在各种挥发性成分相对定量的基础上，根据参考文献中各挥发性物质在水中的香气阈值，按下式计算各成分的ROAV：

式中：Ci为茶叶组分的相对含量/%；Ti为组分i在水中的香气阈值/（μg/kg）；Cmax与Tmax为对样品总体风味贡献最大的组分的相对含量/%和香气阈值/（μg/kg）。

ROAV≥1的组分被确定为茶叶中的活性香气化合物，0.1≤ROAV＜1的组分被认为对样品的总体风味具有重要的修饰作用。

1.3.3 GC-O分析

GC-O条件：升温程序同GC-MS分析条件；嗅闻口与质谱端的分流比例1∶1；进样口温度230 ℃；传输线温度260 ℃；载气为高纯氮气（99.99%）。

嗅闻分析小组由5 名具有丰富审评经验的审评员组成（2 男，3 女），所有嗅闻人员均具有多年的专业茶叶审评经验，并经过了至少30 h的嗅闻培训，熟悉不同浓度茶叶香气标准品的香气强度及香气特征；在实验过程中至少有3 名评价员在同一嗅闻时间处能得到相同的感官描述，则将该记录记入最终结果。感官评价员不仅要描述化合物的气味性质，还要确定化合物的气味强度。香气强度用数值1～4表示，1表示香气强度弱，2表示香气强度中等，3表示香气强度强，4表示香气强度非常强。

1.4 数据处理

采用Excel 2010软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 六堡茶香气成分的HS-SPME-GC-MS分析

如表1、图1所示，共鉴定出81 种共有挥发性化合物，可分为醇类、醛类、酮类、酯类、碳氢类、氧杂环类、酸类及酚类8 类。其中，碳氢类的数量最多（21 种），醇类（16 种）、酮类（12 种）、醛类（9 种）次之，酸类最少（2 种）。此外，在不同种类香气成分的含量上，碳氢类化合物拥有最高的相对含量（23.76%），醇类化合物（19.07%）和酮类化合物（12.18%）次之，再次为醛类化合物（8.98%）和氧杂环化合物（8.69%），酸类化合物最少（0.43%）。由此可见，碳氢类化合物在六堡茶挥发性成分中含量十分丰富，化合物数量多且相对含量总量高。

碳氢类化合物中，十一烷的相对含量最高（8.00%），该成分在六堡茶的挥发性成分研究中曾有报道[9]；其次为1-亚甲基-1H-茚（2.65%），该成分曾被报道为赤霞珠葡萄中重要呈香成分[15]，而在以往六堡茶的研究中未见报道；柠檬烯（2.37%）具有愉快的新鲜橙子香气，曾被报道为六堡茶的重要香气组成成分[8]，这与本研究结果基本一致；此外，有研究表明，柠檬烯是轻度闷堆六堡茶中的高含量成分，而在中度及重度闷堆样品中则含量相对较少[7]。醇类成分是黑茶中重要的挥发性香气化合物组成成分[16]，本研究发现，雪松醇（温和木香、陈香）是六堡茶中含量最高的醇类化合物（5.11%），而有研究表明它是六堡茶的特征性香气成分[7]；芳樟醇氧化物II（2.29%）也具有类似木香的气味特征[17]，研究表明该物质是普洱茶及六堡茶中醇类物质的主体[18]；此外，α-萜品醇（2.50%）与芳樟醇（2.36%）均表现出典型花香特征，是茶叶中十分关键的香气成分[19]。2-茨酮（3.09%）是本研究中相对含量最高的酮类物质，它是一种双环饱和萜烯酮，具有难溶于水的特性[20]；苯乙酮（1.74%）稀释后具有坚果、水果风味。壬醛（1.87%）及臧红花醛（1.36%）是2 种相对含量较高的醛类物质，前者属于脂肪族醛，具有脂肪、柑橘类气味；而臧红花醛则属于芳香族醛，具有木香、陈香气味特征。2-正戊基呋喃（1.53%）具有豆香、果香及青香，在氧杂环化合物中含量较高，该物质也曾被认为是茯砖茶中的高含量成分[21]。水杨酸甲酯（1.44%）（冬青油香气）为芳香族酯类，是已报道的六堡茶中槟榔香的主要香气成分[22]，其含量有随六堡茶贮藏年份增加而增加的趋势[23]。酚类化合物中仅2,3,4-三甲氧基苯酚（1.24%）的相对含量大于1%，酸类化合物总体相对含量较低，只有0.43%。

表1 六堡茶的挥发性成分组成及其相对含量Table 1 Volatile components and their relative contents in Liupao tea samples

续表1

图1 六堡茶中挥发性化合物种类及相对含量Fig.1 Relative contents of various classes of volatile aroma compounds in Liupao tea

2.2 六堡茶香气成分的ROAV分析

食品领域相关研究表明，超过10 000 种挥发性成分已被相继检测和报道，然而研究发现其中仅有很少一部分成分能够影响食品的整体呈香，这类挥发性成分被称作为“关键香气成分”[24]。可见，挥发性成分含量的高低并不能说明其对六堡茶香气品质贡献度的大小，六堡茶的关键香气成分还需要结合ROAV计算与GC-O-MS分析作进一步判断。

表2 六堡茶中香气成分的ROAVTable 2 Relative odor activity values (ROAVs) of aroma compounds in Liupao tea samples

通过ROAV计算，从六堡茶中共鉴定出8 种ROAV不小于1（10 个样品的平均值）的关键香气成分，如表2所示，即1-甲基萘、癸醛、雪松醇、β-紫罗兰酮、壬醛、α-紫罗兰酮、芳樟醇及1-辛烯-3-醇。其中，1-甲基萘是一种具有“刺鼻、酸味”气味特征的多环芳烃类化合物，是已报道的青砖茶中的关键香气成分[25]；由于其气味阈值极低（0.02 μg/kg），1-甲基萘具有最高的ROAV；此外，该物质在本研究后续的GC-O嗅闻实验中同样表现出了较高的气味强度，推测1-甲基萘对六堡茶的香气品质可能具有重要的贡献作用。癸醛在本研究中具有较高的ROAV（28.60），它具有明显的醛类化合物的气味特征及脂肪、柑橘类气味，主要生成于美拉德反应，曾被报道是清香型铁观音的清香味主要来源[26]。雪松醇的ROAV为28.39，其气味阈值为0.5 μg/kg，带有淡雪松木香，是六堡茶中的主要香气成分，其含量具有随六堡茶陈化时间延长而升高的趋势[7,22]。β-紫罗兰酮（ROAV=12.35）的气味阈值较低，表现出典型的紫罗兰、覆盆子及花香的气味特征，被认为是黑茶“陈香”的重要贡献成分之一[7]，在普洱茶中含量丰富[27]；α-紫罗兰酮（ROAV=2.50）也具有类似于β-紫罗兰酮的花香特征，但其木香更为突出。壬醛（ROAV=5.19）（蜡烛、脂肪、甜橙及花香）为饱和脂肪酸，被认为是六堡茶木香以及药草香的贡献成分[28]，也是普洱茶清香、焦香及花香的贡献成分[29]。此外，芳樟醇（ROAV=1.09）及1-辛烯-3-醇（ROAV=1.06）均为茶叶中常见的重要挥发性成分，芳樟醇表现为甜香、花香及橙子气味；而1-辛烯-3-醇表现为类似蘑菇的气味以及青香。

通过ROAV的计算，发现6 个对六堡茶香气品质具有修饰作用的香气化合物（0.1≤ROAV＜1），即苯甲醛、2-正戊基呋喃、柠檬烯、苯乙醛、β-柠檬醛以及水杨酸甲酯。这些成分的香气特征差异较大。例如，苯甲醛（ROAV=0.98）具有类似杏仁、樱桃的香气以及甜香；2-正戊基呋喃（ROAV=0.71）则表现出果香、青香以及金属气味；柠檬烯（ROAV=0.66）表现出愉悦的橙子香气；苯乙醛的香气特征与β-柠檬醛类似，均带有花香甜香及青香特征；而水杨酸甲酯具有明显的薄荷香气，在绿茶、乌龙茶及红茶当中均有检测到[30]，推测这些物质可能会与其他挥发性成分产生协同作用，促进六堡茶“陈香”品质的形成。

2.3 六堡茶中香气成分的GC-O-MS分析

表3 六堡茶样品的GC-O-MS分析Table 3Results of GC-O-MS analysis of aroma components in Liupao tea samples

通过GC-O-MS分析，从六堡茶中共鉴定得到26 个嗅感香气化合物，如表3所示。主要包括2 个碳氢化合物、4 个酮类化合物、12 个醛类化合物、2 个醇类化合物、6 个氧杂环化合物。根据化合物呈香差异，26 种化合物大致可分为5 种气味类型：I：清香、青气及类似青豆的气味；II：芳香及花香气味；III：果香及甜香气味；IV：陈香及木香；V：樟脑、泥土等特殊气味。

GC-O-MS嗅闻表现为I型香气特征的化合物数量最多，共有11 种，主要包括部分醛类、酮类化合物（如β-环柠檬醛、2-茨酮等），以及1,3,8-对薄荷三烯等。β-环柠檬醛的香气阈值为5 μg/kg，该物质在不同浓度条件下会呈现出如青草气、木香、烟叶味等不同的香气特征[31]。作为六堡茶中的高含量酮类化合物，2-茨酮的香气强度为2，在本嗅闻实验中表现为淡青香，这与2-茨酮在以往研究中所呈现出的樟脑味有所不同，推测原因主要与2-茨酮在不同分析物中的浓度不同有关。1,3,8-对薄荷三烯是肉桂香型凤凰单丛的特有成分之一，目前尚无六堡茶中1,3,8-对薄荷三烯的报道。

GC-O-MS嗅闻表现为II型香气特征的化合物共7 种，分别为正辛醛、2-乙基己醇、壬醛、1,2,4,5-四甲苯、长叶烯、β-紫罗兰酮以及联苯。正辛醛及2-乙基己醇均表现为典型的花香，曾在普洱茶GC-O分析中检测[29]。长叶烯表现为甜花香，是小种红茶中特有且含量最为丰富的化合物之一[32]，自然条件下长叶烯则大多存在于多种松树的树脂中[33]，因此，六堡茶加工过程中的烟熏烘干可能导致长叶烯的产生。β-紫罗兰酮嗅闻实验中表现为愉悦的紫罗兰香气，它在六堡茶中相对含量并不高（0.40%），但由于其具有较低的阈值，因此在ROAV的计算及GC-O嗅闻中均表现出了较强的化合物特征。

GC-O-MS嗅闻表现为III型香气特征的化合物共有4 种：α-萜品醇、香叶基丙酮、苯甲醛以及2-己烯醛，均为茶叶当中较为常见的香气组分。在六堡茶样品中，α-萜品醇香气强度（3）与平均相对含量（2.5%）均较高，该成分也是普洱茶[14]、安化黑茶[18]中的重要醇类主体。苯甲醛表现出杏仁及甜香风味。

GC-O-MS嗅闻表现为IV型即陈香及木香特征的化合物为1,2,3-三甲基苯及1,1,6三甲基-1,2-二氢萘。1,2,3-三甲基苯具有“陈香”特征，是普洱茶等黑茶中的重要呈香成分之一。六堡茶中1,1,6三甲基-1,2-二氢萘的研究鲜见报道，该物质曾在青砖茶中被检测到[34]。

GC-O-MS嗅闻表现为V型具有特殊气味特征一类物质主要为萘的化合物，包括1-甲基萘（刺激性气味、樟脑）及2,3,5-三甲基萘（泥土味）。1-甲基萘曾在绿茶、黑茶等被检测得到[29,35]，多表现出较为明显的辛辣刺激等不愉悦的气味特征，然而，研究表明该物质的含量存在随时间延长而上升的趋势，从而逐渐表现为类似香樟木的气味特征[36]；现有研究表明2,3,5-三甲基萘是川楝子中含量较高的挥发性成分[37]，但目前有关茶叶中2,3,5-三甲基萘的研究报道较少。

2.4 六堡茶关键香气化合物分析鉴定中ROAV分析和GC-O-MS方法的比较

分析比较表2和表3结果，可知这2 种方法能够共同检测到的挥发性香气化合物有4 种，即1-甲基萘、雪松醇、β-紫罗兰酮和壬醛，推测这些挥发性香气化合物对六堡茶的“陈香”香气品质形成具有极其重要的贡献。然而，ROAV计算及GC-O-MS分析仍无法准确判定六堡茶中的关键香气成分，在后续实验中还需要通过香气重组及消减实验等进行关键香气成分的验证分析等。但现有研究表明，茶叶香气重组基质难以模拟，化合物定量结果难以精确确定，这无疑是茶叶中关键香气成分验证的难点之一。除此之外，实验结果表明，这2 种方法鉴定出的化合物类别也有较大的差异；究其原因，诸如化合物较高的阈值、茶叶基质影响香气成分的释放等因素均会在一定程度上造成2 种实验方法结果的差异。此外，值得注意的是，单个挥发性化合物对六堡茶香气品质的贡献不仅取决于其在茶叶中的含量，更与挥发性成分之间、挥发性成分与非挥发性成分之间的协同作用、消减作用等密切相关[38]。因此，在后续研究中，还需要进一步针对非挥发性成分、低ROAV化合物对六堡茶香气品质的影响展开相关研究。

3 结 论

本研究采用HS-SPME-GC-MS技术分析六堡茶挥发性成分的组成和含量情况，在10 个代表性六堡茶样品中鉴定出了8 类共计81 种共有挥发性香气化合物；研究表明，六堡茶挥发性成分中含有丰富的碳氢类、醇类、酮类、醛类、氧杂环类、酯类、酸类以及酚类化合物，其中十一烷、雪松醇、2-茨酮、1-亚甲基-1H-茚、α-萜品醇、芳樟醇及芳樟醇氧化物II、柠檬烯、壬醛、水杨酸甲酯、2-正戊基呋喃等是六堡茶中含量丰富的挥发性香气化合物。

通过ROAV计算，确定了六堡茶中14 种高香气活性值化合物，主要包括1-甲基萘、癸醛、雪松醇、β-紫罗兰酮、壬醛等；此外，GC-O-MS分析揭示了可能对六堡茶“陈香”香气品质的形成具有重要贡献作用的26 种挥发性香气化合物。由ROAV法分析和GC-O-MS分析共同检测到1-甲基萘、雪松醇、β-紫罗兰酮及壬醛4 种挥发性香气化合物，表明它们对六堡茶的“陈香”香气品质可能具有极其重要贡献，是六堡茶“陈香”特性的关键香气成分。该研究结果可为六堡茶“陈香”香气品质的科学评价和提高六堡茶香型定向加工技术等提供重要科学依据。