酵母葡聚糖的前处理及其对白鲢鱼肉的去腥效果

黄晶晶，张慧敏，赵丽媛，熊善柏，黄琪琳

（华中农业大学食品科学技术学院，环境食品学教育部重点实验室，湖北 武汉 430070）

白鲢（Hypophthalmichthys molitrix）是生长在中上层温水的淡水鱼，以浮游生物（尤其是浮游植物）为食，具有生长快、抗病性强、产量高、价格便宜等优点[1]。此外，白鲢鱼肉中富含优质蛋白（15%～18%鱼肉）和多不饱和脂肪酸，肉质细腻易消化[2-4]。但因自身生理条件及生活环境的影响而具有令人不愉快的气味，主要体现为人们常说的鱼腥味，因此不被一些消费者所接受，导致其加工和消费价值降低[5]。

淡水鱼中的腥味主要来源于环境中微生物的代谢、不饱和脂肪酸的氧化及酶的催化分解氧化三甲胺产生不良气味物质[6]。目前，水产品去腥方法主要分为物理法，如利用β-环糊精包埋腥味法[7]；生物法，如发酵去腥法[8]；化学法，如利用茶多酚抑制脂肪氧化[9]等，其中物理化学法有着操作技术较为简单的特点，且能达到良好的去腥效果。酵母细胞含有大量营养成分，当酵母自溶后，大部分蛋白质、氨基酸和核苷酸可提取制成酵母抽提物。已有研究发现酵母抽提物可利用自身的风味丰富巴非蛤水解液的风味，降低醛酮类物质的相对含量，达到去腥目的[10]。酵母细胞壁则可用于提取一种功能性多糖——酵母葡聚糖，也具有一定酵母风味。本实验室在前期研究中发现酵母葡聚糖在增强白鲢鱼糜凝胶特性的同时，还能够改善鱼糜凝胶的感官品质，有一定消减腥味的作用，但消减机制尚不明确[11]。

因此本研究选择碱提和热水洗2 种方式对酵母葡聚糖进行前处理，以白鲢鱼肉为研究对象，通过感官评价、电子鼻技术及顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法，研究经过前处理的酵母葡聚糖的添加对白鲢鱼肉整体风味的影响及挥发性成分的组成和含量的变化；从气味吸附和脂肪氧化的角度探究酵母葡聚糖消减白鲢鱼肉腥味的机理。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白鲢（约2 kg），购于华中农业大学农贸市场。将活鱼带水运到实验室，即用。

酵母葡聚糖（β-葡聚糖≥85.0%） 安琪酵母股份有限公司；1,2-二氯苯（色谱纯） 美国Sigma公司；氢氧化钠、氯化钠、丙酮、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸、2,6-二叔丁基对甲酚（butylhydroxytoluene，BHT）（均为分析纯） 上海国药集团化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

FD-1A-50型冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；DF-101S型磁力搅拌器 郑州长城工贸有限公司；FOX4000型电子鼻 法国Alpha M.O.S公司；7890B-5977A型气相色谱-质谱联用仪 安捷伦科技有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头 上海楚定分析仪器有限公司；UV-1750型紫外-可见分光光度计日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母葡聚糖前处理

热水洗处理：称取5 g酵母葡聚糖加入1 000 mL蒸馏水中，100 ℃水浴搅拌30 min后离心，取沉淀进行冷冻干燥，得到热水洗处理的酵母葡聚糖（简写为热水洗YG）。

碱提处理：将5 g未处理的酵母葡聚糖置于索氏提取器中依次用50 mL乙酸乙酯和丙酮分别回流6 h，以除去其中的脂肪。将脱脂后的酵母葡聚糖用150 mL、2 mol/L氢氧化钠溶液在4 ℃搅拌提取12 h后，4 500 r/min离心10 min，得到的上清液用盐酸中和至中性后离心，沉淀物先经自来水透析6 d再经蒸馏水透析3 d后冷冻干燥，得到碱提处理的酵母葡聚糖（简写为碱提YG）。

1.3.2 酵母葡聚糖挥发性成分测定

分别称取未处理酵母葡聚糖（对照组）、热水洗YG和碱提YG 0.06 g于顶空瓶中，加入7 mL饱和氯化钠溶液和内标物（1,2-二氯苯，1 μg/mL，300 μL），放入微型磁力搅拌转子，密封，并置于磁力加热搅拌器中；60 ℃平衡3 min，用已活化好的DVB/CAR/PDMS萃取头顶空吸附50 min；将萃取完全的萃取头插入气相色谱-质谱进样口，解吸5 min。

气相色谱条件：HP-5MS（5%苯基）甲基硅氧烷毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升温：40 ℃保持3 min，以5 ℃/min升至200 ℃，保持2 min，再以50 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。进样口温度250 ℃，载气（He）流量1 mL/min，不分流。

质谱条件：电子电离源；传输线温度280 ℃；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；质量扫描范围m/z35～450。

样品中各挥发性成分的含量（ci）按式（1）计算：

式中：Ai、Ais分别为各挥发性成分和内标物质的峰面积；Wis、W分别为内标物质量（300 ng）和不同前处理酵母葡聚糖质量（0.06 g）。

1.3.3 感官评价

新鲜白鲢用冰水清洗干净后“三去”（去头、去鳞、去内脏），手工采肉，保持鱼肉温度不超过10 ℃，鱼肉绞碎后备用；取绞碎后的鱼肉，添加2%的酵母葡聚糖混合均匀后备用。

参考付湘晋等[12]的方法并稍作修改。取新鲜鱼肉和鱼肉-酵母葡聚糖复合物各20 g于棕色试剂瓶中。在30 ℃培养箱中放置30 min。选择11 名前期经过训练的感官评定员（年龄在18～35 岁）进行感官分析，选取5 种感官描述词：青草味、鱼腥味、水果味、土霉味、酵母味。以各感官气味标准品作为对照，采用9 分制进行感官评价，评分标准见表1。

表1 白鲢鱼肉感官评分标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of silver carp meat

1.3.4 电子鼻分析

分别准确称取酵母葡聚糖、新鲜鱼肉、鱼肉-酵母葡聚糖复合物0.04、2、2.04 g于10 mL样品瓶中，旋盖密封待测。每个样品重复测定3 次。

顶空产生参数：产生时间120 s，产生温度50 ℃；振荡速率500 r/min；获得参数：总获取时间120 s，获取间隔时间1 s，获取延滞时间300 s；顶空注射参数：注射体积1.5 mL，注射速率1.5 mL/s；进样针温度60 ℃；载气：合成干燥空气，流速150 mL/min。

1.3.5 鱼肉挥发性成分测定

分别准确称取新鲜鱼肉、鱼肉-酵母葡聚糖复合物3、3.06 g于顶空瓶中，加入7 mL饱和氯化钠溶液和内标物1,2-二氯苯（1 μg/mL，300 μL），放入微型磁力搅拌转子，密封，并置于磁力加热搅拌器中。60 ℃平衡3 min，用已活化好的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头顶空吸附50 min；将萃取完全的萃取头插入气相色谱-质谱进样口，解吸5 min。

气相色谱-质谱测定挥发性成分条件及计算方法同1.3.2节。

特征挥发性成分评价采用气味活度值（odor activity value，OAV）法，评价不同化合物对样品总体气味的贡献，定义为嗅感物质的绝对含量c（μg/g）与其感觉阈值T（μg/kg）之比，按式（2）计算：

1.3.6 硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reaction substrate，TBARS）值测定

将新鲜鱼肉、鱼肉-酵母葡聚糖复合物和鱼肉-BHT（0.05%）复合物（阳性对照）分别在0、25、35、60 ℃放置2 h。准确称取5.0 g样品于20 mL 3.75 g/L硫代巴比妥酸-150 g/L三氯乙酸-0.25 mol/L HCl的混合液中，充分混匀后，沸水浴加热20 min，碎冰冷却，4 000 r/min离心10 min，取上清液于波长532 nm处测定吸光度。以1,1,3,3-四乙氧基丙烷为标准品制备标准曲线，结果以每千克鱼肉中所含质量计。

1.4 数据处理

所有实验数据以Origin 9.0（Origin-Lab, Northampton,MA, USA）和Excel 2010进行处理，采用SPSS 22.0（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）进行ANOVA单因素方差分析及Duncan检验（P＜0.05），数据以±s表示。

2 结果与分析

2.1 前处理对酵母葡聚糖挥发性成分的影响

表2 不同前处理方式下酵母葡聚糖的挥发性成分分析Table 2 Analysis of volatile components of yeast glucan pretreated by different methods

来源于酵母细胞的酵母葡聚糖会自带酵母风味[13]。如表2所示，对照组中共检测出30 种挥发性成分，主要包括醛类10 种、酮类9 种、醇类2 种、酸类2 种、烃类1 种和酯类6 种，其中含量较高的物质有庚醛、辛醛、壬醛、2-辛烯醛、2-壬烯醛、庚醇、2-辛酮、2-壬酮、环辛烷，而辛醛含量最高达到47.59 μg/g，是酵母葡聚糖主要挥发性成分。碱提YG中共检测到20 种挥发性成分，且大部分物质的含量小于对照，其中辛醛和2-壬烯醛的含量分别减少了31%和62%。而热水洗YG中共检测到9 种挥发性物质，主要为醛类8 种、酮类1 种。与对照相比，除2-癸烯醛，其各挥发性成分含量均显著减少（P＜0.05），其中低阈值的辛醛含量降低到23.97 μg/g，减少了50%，而2-壬烯醛未检出。

通过以上分析，热水洗处理和碱提处理均可降低酵母葡聚糖挥发性成分的种类及含量，其中热水洗处理的效果更显著，特别是对其风味贡献较大的辛醛、2-庚烯醛等物质含量降低效果明显，说明其能很好地去除酵母葡聚糖本身的风味物质，因此选择热水洗的处理方式对酵母葡聚糖进行前处理，然后用于后续实验。

2.2 前处理酵母葡聚糖对白鲢鱼肉感官的影响

图1 酵母葡聚糖对白鲢鱼肉气味的影响Fig.1 Sensory odor profile analyses of silver carp meat with and without hot water-washed yeast glucan

如图1所示，新鲜白鲢鱼肉的气味主要以鱼腥味、青草味、土霉味为主，也有少许的水果味，其中鱼腥味最重得分为5.73。鱼肉加入热水洗YG后，鱼腥味和青草味明显降低，分别降至3.82 分和2.27 分，土霉味也有所减弱，表明经热水洗YG在一定程度上可以降低鱼肉整体气味。

2.3 电子鼻判别前处理酵母葡聚糖对白鲢鱼肉气味的影响

2.3.1 主成分分析（principal components analysis，PCA）结果

PCA是目前常用分析方法，它能够将几组数据进行降维，通过线性分类反映出样品的信息，最终在散点图上显示为所需的二维散点图[11,16]。PCA能够将不同样品按照主成分划分在不同的区域，区域之间的距离表示不同样品之间的差异，距离越远，说明不同样品之间气味的差异越大[17]。

图2 酵母葡聚糖处理前后白鲢鱼肉PCA图Fig.2 PCA plots of silver carp meat with and without hot water-washed yeast glucan

由图2可以看出，PC1贡献率为96.462%，PC2贡献率为2.447%，两者之和为98.909%，说明PC1和PC2包含了样品的大量信息，可以较好地反映样品的信息[18]。由图2可知，3 种样品的气味差异主要体现在PC1轴上，且分别分布在不同区域内，样品之间没有重叠，说明电子鼻的PCA能够对新鲜鱼肉、鱼肉-酵母葡聚糖复合物和酵母葡聚糖的整体气味进行有效区分。从分布的区域看，酵母葡聚糖样品与鱼肉-酵母葡聚糖复合物样品之间分布距离较远，表明它们之间的气味差异较大，即鱼肉-酵母葡聚糖复合物主要以鱼肉的气味为主导；此外，新鲜鱼肉与鱼肉-酵母葡聚糖复合物分布具有一定的距离，两者之间没有重叠，说明添加热水洗YG确实会对鱼肉的整体气味产生影响，与感官评价结果一致。

判别指数（discrimination index，DI）是电子鼻在进行PCA时表征不同样品之间的区分程度的一种表征值，当DI位于80～100之间时说明不同样品之间的区分度良好，且DI越大区分效果越好[19]。由图2可知，酵母葡聚糖添加前后白鲢鱼肉PCA的DI为93，说明PCA法能够对新鲜鱼肉、鱼肉-酵母葡聚糖复合物和酵母葡聚糖3 种样品进行有效区分。

2.3.2 判别因子分析（discriminant factor analysis，DFA）结果

DFA是在PCA之后，进一步将响应信号数据进行区分，从而可以将不同样品之间的气味差异放大[20]。与PCA类似，若DFA的不同组数据分布越分散，说明样品之间气味的差异越明显。与图2相比，图3中各组分的差异明显扩大，且每组样品的聚集度较为紧密，说明重复性较好。DF1与DF2的贡献率分别为99.857%和0.143%，累计贡献率达到100%。说明DFA也能较全面地代表3 个样品的信息。

图3 酵母葡聚糖对白鲢鱼肉DFA图Fig.3 DFA plots of silver carp meat with and without hot water-washed yeast glucan

2.4 前处理酵母葡聚糖对鱼肉中挥发性成分影响

通过顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法分析，在新鲜鱼肉和鱼肉-酵母葡聚糖复合物中分别检测出23 种和22 种挥发性成分。在白鲢鱼肉中加入热水洗YG后，鱼肉中的挥发性物质的含量及数量都有所减少。

2.4.1 醛类化合物

醛类化合物是脂质降解的产物，在挥发性成分中其含量较高且阈值较低，对鱼肉的整体风味形成贡献较大[21]。如表3所示，在新鲜鱼肉中共检测到11 种醛类化合物，且含量相对较高，占总挥发性成分的33.9%，其中己醛含量最高，达到了486.94 μg/kg。有研究报道，己醛主要是由多不饱和脂肪酸（亚油酸和亚麻酸）氧化降解产生，其风味对鱼肉的腥味有较大贡献[15,21]；此外，壬醛、2-辛烯醛、2,4-癸二烯醛也被证实是造成水产品产生鱼腥味的物质[6,14,22]。OAV可用于表示每种挥发性物质对样品的贡献程度，当OAV＜1时，表明嗅觉器官对该物质无感觉，该物质对样品总体气味无显著作用；当OAV≥1时，说明该物质可能对样品总体气味有直接影响；且在一定范围内，OAV越大说明该物质对样品总体气味的贡献越大[23]。通过OAV分析可知，对白鲢挥发性气味贡献较大（OAV≥1）的醛类主要有己醛、壬醛、辛醛、庚醛、癸醛、2,4-癸二烯醛、2-辛烯醛，其中辛醛的OAV最高，达到316.81，由气味描述可知辛醛为油脂味、青草味，对白鲢鱼肉的整体风味起主要作用。

由表3可知，鱼肉加入热水洗YG后，醛类化合物约占24.98%，其中己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛、2-辛烯醛、2,4-癸二烯醛的含量均有不同程度的减少，且酵母葡聚糖添加前后己醛、庚醛和壬醛的含量差异显著（P＜0.05）。由气味描述可知这3 种物质主要味道为青草味和鱼腥味，这也是感官评价中白鲢鱼肉加入酵母葡聚糖后青草味和鱼腥味明显降低的原因。通过内标法定量计算，对鱼腥味贡献较大的己醛、壬醛含量从486.94、318.59 μg/kg降至375.49、240.53 μg/kg，下降率分别为22.9%和24.5%，这是由于酵母葡聚糖对鱼肉中的挥发性成分有吸附作用，从而降低鱼肉中腥味物质含量以降低腥味。实验室在前期研究酵母葡聚糖对鱼肉中土腥味物质的影响时也发现了酵母葡聚糖能够对土霉味物质吸附结合，影响土霉味物质的释放[11]。

2.4.2 醇类化合物

在新鲜鱼肉中共检测出3 种醇类物质，分别为1-辛烯-3-醇、庚醇和壬醇，其中1-辛烯-3-醇含量最高。醇类物质是脂肪在脂肪氧化酶的作用下发生氧化而产生的[24]。一般认为，不饱和醇类化合物的阈值都相对较低，对鱼肉气味的贡献相对较大，而饱和醇类化合物的阈值较高，对鱼肉的挥发性气味贡献较小[11,25]。由表3可知，不饱和醇类物质1-辛烯-3-醇的OAV为122.54，对鱼肉的气味贡献较大，它被广泛地报道为生蘑菇的气味，是饱和脂肪酸在酶的作用下催化氧化产生[15]。另外，在新鲜鱼肉中也检测到的庚醇具有坚果味和淡芳香气味，其OAV为10.49，因此也是白鲢鱼肉的特征挥发性成分之一[11]。此外，检测到的呈油脂味的壬醇对鱼肉的风味起一定的修饰作用，贡献不大。

加入酵母葡聚糖后，鱼肉-酵母葡聚糖复合物中仅检测出1-辛烯-3-醇和庚醇2 种醇类化合物，呈现油脂味的壬醇未检出。由内标法计算可知对鱼腥味贡献较大的1-辛烯-3-醇含量与新鲜鱼肉相比存在显著差异，由原来的183.81 μg/kg下降至128.86 μg/kg，减少了30.0%，同样说明经酵母葡聚糖可在一定程度上吸附去除白鲢鱼肉的腥味物质。

2.4.3 酮类化合物

酮类物质由于其阈值相对较高，因此对鱼肉整体的气味贡献相对较小[26]。如表3所示，在新鲜鱼肉中共检测出3,5-辛二烯酮、2,5-辛二酮2 种酮类物质，种类少且含量较低，对鱼肉的总体气味贡献较小（OAV＜1）。添加酵母葡聚糖后3,5-辛二烯酮的含量减少，2,5-辛二酮的含量有所增加。

2.4.4 烃类化合物

在新鲜鱼肉中共检测到7 种烃类物质，其中烷烃类5 种，烯烃类2 种，而烷烃类化合物含量较高。这些化合物可能是类胡萝卜素的分解或烷基自由基的脂质氧化过程生成的产物[25]。有研究认为，烃类化合物在形成对肉的风味有较大贡献的杂环化合物的过程中，起到了重要作用，对形成肉的整体风味具有不可忽视的作用，而烯烃类化合物在一定条件下可转化为醛类和酮类物质，因此烃类物质也是能形成鱼特征风味的一种潜在物质[11,27]。由表3可知，在新鲜鱼肉中检测出的十七烷和8-十七烷烯的含量相对较高，这与其他报道一致[22,28]。当鱼肉中加入前处理过的酵母葡聚糖后，十四烷、十七烷、8-十七烷烯含量略有增加，其他烷烃含量均有所降低。

表3 酵母葡聚糖处理对白鲢鱼肉中挥发性成分的影响Table 3Effect of addition of hot water-washed yeast glucan on volatile components in silver carp meat

2.5 前处理酵母葡聚糖对白鲢鱼肉TBARS值的影响

图4 温度对酵母葡聚糖处理白鲢鱼肉TBARS值的影响Fig.4 TBARS values in silver carp meat with and without hot water-washed yeast glucan after 2 h storage at different temperatures

TBARS值代表脂肪氧化的程度，脂肪氧化后产生的醛酮类物质会造成鱼肉产生腥味，因此TBARS值与腥味密切相关[21]。当TBARS值大于2.0 mg/kg时，鱼肉会产生明显的腥味[30]。由图4可知，随着温度的升高，白鲢鱼肉（空白对照组）的TBARS值升高。与空白对照组相比，在0 ℃时，加入热水洗YG的鱼肉TBARS值最低，仅为0.20 mg/kg，远低于空白对照组的0.31 mg/kg。在0～40 ℃处理温度下，鱼肉-酵母葡聚糖复合物和鱼肉-BHT复合物（阳性对照组）的TBARS值显著低于空白对照组，且鱼肉-酵母葡聚糖复合物TBARS值低于阳性对照组。阳性对照组中的抗氧化剂BHT可通过清除自由基抑制脂肪氧化，因而常被应用在食品中减小因脂肪氧化而产生的异味[12]。由此可知，酵母葡聚糖具有与BHT相当的功能，也可以抑制脂肪氧化从而减小鱼肉中的腥味。有研究表明，β-葡聚糖具有抗氧化能力，可螯合金属离子，清除超氧化物，还可以作为氢质子的供体，稳定自由基，从而抑制脂肪氧化[31-32]。当温度升至60 ℃时，阳性对照组的TBARS值较小，而鱼肉-酵母葡聚糖复合物与空白对照组相比，TBARS值没有明显差异。这是由于在较高温度时，脂肪氧化速率会急剧增大，酵母葡聚糖在抑制脂肪氧化的能力上则劣于传统小分子抗氧化剂BHT。

3 结 论

酵母葡聚糖自带酵母风味，通过顶空固相微萃取-气相色谱-质谱检测到其中含有30 种挥发性成分，通过热水洗法处理过的酵母葡聚糖仅含9 种，且对风味贡献较大的2-壬烯醛和辛醛含量降低明显。将热水洗YG添加至鱼肉中，鱼肉的鱼腥味和青草味显著降低，土霉味也有所减弱，与新鲜鱼肉风味具有显著差异。通过气相色谱-质谱分析新鲜鱼肉共有23 种挥发性成分，其中己醛、壬醛、辛醛、2,4-癸二烯醛和1-辛烯-3-醇是鱼特征风味的主要贡献者。将热水洗YG添加至鱼肉中后，以上5 种物质含量均有不同程度的减小，且通过内标法计算己醛、壬醛和1-辛烯-3-醇的含量分别减小了22.9%、24.5%和30.0%，表明酵母葡聚糖可与风味物质吸附结合从而减小白鲢特征气味。此外，酵母葡聚糖在较低温度（≤37 ℃）时可降低鱼肉的TBARS值，证明其还能抑制鱼肉的脂肪氧化，从而减小其腥味物质的产生。