L-赖氨酸对鸡腿肉肌原纤维蛋白磷酸化的影响

方 芮，朱宗帅，郭秀云，彭增起，张雅玮

（南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）

蛋白质磷酸化作为一种蛋白质翻译后的重要修饰方式，已经在医学、生物化学等领域有广泛的研究，但在肉品科学领域中研究较少，目前主要集中在蛋白质磷酸化与宰后肉品质的关系方面[1]。已有研究表明，相对较低磷酸化水平的肌原纤维蛋白更容易被钙蛋白酶降解，从而有利于提高肉的嫩度，改善肉的品质[2-3]，蛋白质磷酸化还可以通过影响与糖酵解有关酶的活性或稳定性，从而影响宰后僵直过程，进一步影响肉的品质[4-6]。此外，蛋白质磷酸化可以负向调控肉色稳定性，主要由于肌红蛋白发生磷酸化后改变了二级结构的稳定性，导致其氧化速率增加，肉色下降[7-8]。

在肉品加工过程中添加食盐可以提高肉的保水性、增强产品的质构特性，并赋予产品良好的风味[9]。研究表明，使用质量分数3%食盐腌制16 h后，能够显著降低肌肉的肌原纤维蛋白的整体磷酸化水平[10]，食盐腌制可通过抑制碱性磷酸酶和蛋白激酶A活性间接调节肌原纤维蛋白磷酸化水平，从而提高肉嫩度。然而钠摄入量过高会增加高血压和心血管疾病等发生的风险[11]，《中国食品工业减盐指南》指出，我国是食盐摄入量最高国家之一，有研究报告指出，我国是全球中风发病率最高的国家，而我国的中风发病率高的原因主要与高钠摄入有关[12]。我国高盐饮食由来已久，而来源于肉制品的NaCl摄入占人均每日摄入含量的25%[13]，为了国民健康可持续发展，肉制品加工过程的减盐行动刻不容缓。

前期研究表明，在低盐条件下（1 mmol/L和0.15 mol/L NaCl）添加5 mmol/LL-赖氨酸（L-Lys）能够使肌球蛋白分子发生解折叠，蛋白构象发生改变[14]，显著提高肌球蛋白溶解性；使用含L-Lys的氨基酸型低钠盐加工风干咸草鱼能够抑制脂肪氧化程度、减少不良风味物质挥发并降低钠含量50%以上[15]。在猪肉肠中添加L-Lys也能显著提高产品的感官评分，赋予良好的色泽[16]。由此可见，L-Lys能够在降低NaCl用量的同时一定程度上改善肉品品质。本实验研究在1% NaCl（低盐）和3% NaCl（高盐）条件下添加L-Lys对鸡腿肉肌原纤维蛋白磷酸化水平的影响，并明确添加L-Lys在腌制鸡腿肉过程中所诱导的磷酸化差异蛋白，旨在为揭示其降低肉中NaCl用量并保持或提高肉品品质的内在原因提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选择30 只同一批次的黄羽肉鸡（月龄3 个月，2.0～2.2 kg），购自南京半步堂农副产品贸易有限公司，三管齐断法宰杀后立即剥皮取出腿肉，剔除明显的结缔组织并切割成大小均一的肉样并混匀，肉样处理在4 ℃低温室下进行（宰杀过程和方法符合南京农业大学动物福利的相关规定）。

二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度试剂盒 南京建成生物工程研究所；L-Lys 上海瑞永生物科技有限公司；蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂瑞士Roche公司；二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘代乙酰胺（iodoacetamide，IAM）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇（trisamine，Tris） 北京索莱宝生物科技有限公司；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）预制胶美国GenScript公司；XT还原剂 美国Bio-Rad公司；20×NuPAGE MES电泳缓冲液、4×NuPAGE LDS样品缓冲液、Pro-Q Diamond染液、Sypro Ruby染液美国Invitrogen公司；测序级胰蛋白酶 美国Promega公司；Ziptip C18枪头型脱盐柱 爱尔兰Millipore公司；甲酸（formic acid，FA）、乙腈（acetonitrile，ACN）均为国产色谱纯；NaCl为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

T25 digtal Ultra Turrax高速匀浆机 德国IKA公司；Allegra 64R高速冷冻台式离心机 美国Beckman Coulter公司；HH-8数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；M2e多功能酶标仪、Mini-PROTEAN Tetra电泳槽、PowerPac Basic基础型电源 美国Bio-Rad公司；SYC-2101水平摇床 美国Crystal公司；Typhoon Trio多功能激光成像系统 美国GE公司；eStain L1蛋白快速染色系统美国GenScript公司；真空浓缩机、nano LC-LTQ-Orbitrap-MS/MS质谱仪 美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 腌制

将混匀的肉块（宰后4 ℃成熟90 min）随机分为15 份，每份称取30 g肉块，分别添加质量分数0% NaCl（对照组）、1% NaCl、1% NaCl＋0.06%L-Lys、3% NaCl和3% NaCl＋0.06%L-Lys，拌匀后置于4 ℃腌制16 h。

1.3.2 肌原纤维蛋白的提取

样品制备参照Huang Honggang[5]和Lametsch[17]等的方法并稍作修改。取8.34 g腌制后的肌肉组织加入50 mL预冷的匀浆缓冲液（100 mmol/L Tris，pH 8.3，1 片蛋白酶抑制剂，2 片磷酸酶抑制剂），9 500 r/min冰浴匀浆2×30 s，然后13 500 r/min冰浴匀浆2×30 s。匀浆液15 000 r/min、4 ℃离心20 min，沉淀为肌原纤维蛋白，沉淀溶解于5% SDS溶液（60 ℃）后9 500 r/min匀浆30 s，80 ℃加热20 min，4 ℃保存备用。使用BCA蛋白浓度试剂盒测定蛋白浓度，用蒸馏水将各样品质量浓度调成4 mg/mL。

1.3.3 SDS-PAGE与荧光染色

参照Li Xiao等[6]的方法并稍作修改进行电泳样品制备。将制备好的电泳样品进行SDS-PAGE，肌原纤维蛋白上样量为6 μg，初始电泳电压为70 V，待条带跑出浓缩胶后，上调电压至120 V，电泳结束后取出电泳胶转入干净的染色盒中，进行固定液固定过夜12 h，结束后用蒸馏水（3×10 min）彻底洗脱固定液，用Pro-Q Diamond 染液进行避光磷酸化染色1.5 h后，避光脱色1.5 h，结束后用蒸馏水（4×5 min）洗脱，用Typhoon进行荧光拍照，随后将胶转入干净的染色盒中，进行Sypro Ruby染液全蛋白避光染色过夜12 h后，回收染液，避光脱色30 min，结束后用蒸馏水（4×5 min）洗脱，再用Typhoon进行第2次荧光拍照。结束后对电泳胶进行考马斯亮蓝染色，使电泳条带清晰可见，便于后续的质谱鉴定。整个过程注意防止角蛋白污染，保持胶面干净无破损。

1.3.4 质谱鉴定

表1 质谱鉴定的流动相组成Table 1Mobile phase composition for LC-MS/MS analysis

肌原纤维蛋白磷酸化水平用Pro-Q Diamond染液染色后的磷酸化条带光密度值P与Sypro Ruby染液染色后全蛋白条带光密度值T的比值（P/T）表示，在超净工作台上用割胶笔割下P/T值差异显著的条带置于1.5 mL离心管中，使用50 μL超纯水清洗和50 μL考马斯亮蓝染色脱色液脱色后，加入50 μL ACN脱水直至条带完全变白，真空抽干后，加10 mmol/L DTT 20 μL，56 ℃水浴1 h；冷却到室温后吸干，快速避光加55 mmol/L IAM 20 μL，避光反应45 min。依次用25 mmol/L NH4HCO3（2×10 min）、25 mmol/L NH4HCO3＋50% ACN溶液（2×10 min）、ACN（10 min）洗，ACN脱水到胶粒完全变白为止，真空抽干10 min，37 ℃下用胰蛋白酶进行消化酶解12～16 h，加入0.02% FA终止反应，离心后吸出液相转至新离心管中，条带用60% ACN-0.2% FA 100 μL萃取2 次，每次15 min，吸出液相，合并于新离心管中后浓缩挥干，加入30 μL 0.2% FA复溶后用Ziptip C18脱盐柱进行脱盐后挥干备用，上机前加入5～10 μL 0.2% FA复溶后全部进入质谱分析。

流动相条件：有机相为ACN，水相添加0.2% FA；流速为0.3 μL/min，不同时间的流动相组成见表1。扫描范围为m/z300～1 800，电压40 V，扫描模式按前5 个丰度Scan Event 1～5进行扫描。

1.4 图像分析与数据处理

使用ImageQuant TL（GE）软件处理电泳胶拍照后的图像，对电泳条带进行光密度值分析后得到相对光密度，使用UniProtKB确定蛋白质种类和功能，所有数据用Microsoft Excel 2016进行分析，使用Origin pro 9.0进行作图，使用SAS V8进行单因素方差分析（ANOVA），采用Duncan多重比较，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 一维SDS-PAGE与磷酸化水平分析

图1 鸡腿肉肌原纤维蛋白整体磷酸化水平Fig.1 Phosphorylation levels of myofibrillar proteins from chicken thigh meat

如图1所示，1% NaCl组和0% NaCl组的磷酸化水平差异不显著（P＞0.05），3% NaCl组较1% NaCl组和0% NaCl组的磷酸化水平显著下降（P＜0.05），此结果与Zhang Caixia等[18]研究一致，而1% NaCl＋0.06%L-Lys组与3% NaCl组相比，在降低NaCl条件下，添加0.06%L-Lys后的肌原纤维整体磷酸化水平无显著差异（P＞0.05），同时1% NaCl＋0.06%L-Lys组较1% NaCl组能够显著降低肌原纤维蛋白整体磷酸化水平（P＜0.05），通过比较可以发现在添加L-Lys时减少钠盐还可以达到高盐条件下的低磷酸化水平。1% NaCl＋0.06%L-Lys组与3% NaCl组之间无显著差异（P＞0.05），3% NaCl＋0.06%L-Lys与3% NaCl组、1% NaCl＋0.06%L-Lys组之间无显著差异（P＞0.05）。结果表明，在低盐（1% NaCl）条件下，L-Lys的添加所引起的磷酸化水平降低，且与3% NaCl处理组无差异。当肌原纤维蛋白整体磷酸化水平降低时，可能会抑制肌肉收缩，代谢酶的活性也会降低[19]，减缓糖酵解反应，影响宰后僵直过程，提高肉的嫩度并促进肉品质的提高[20]。

图2 鸡腿肉磷酸化肌原纤维蛋白SDS-PAGE图谱Fig.2 SDS-PAGE patterns of phosphorylated myofibrillar proteins from chicken thigh meat

图3 鸡腿肉肌原纤维全蛋白SDS-PAGE图谱Fig.3 SDS-PAGE patterns of total myofibrillar proteins of chicken thigh meat

从图2、3可以看出，肌原纤维蛋白条带电泳结果平直清晰，蛋白分离效果较好，从中选择16 个条带，用ImageQuant TL软件进行相对光密度分析，得到16 个条带的磷酸化水平结果如表2所示。

表2 添加L-Lys对鸡腿肉肌原纤维蛋白磷酸化水平的影响Table 2 Effect of L-Lys on phosphorylation levels of myofibrillar proteins from chicken thigh meat

注：同列字母不同表示差异显著（P＜0.05），n=3。

由表2可以看出，条带8、9、13、14的3% NaCl组较1% NaCl组和0% NaCl组的磷酸化水平显著降低（P＜0.05），条带1、4、8、10、12、15、16的1% NaCl＋0.06%L-Lys组较1% NaCl组的磷酸化水平显著降低（P＜0.05），条带5、6、9、12的1% NaCl＋0.06%L-Lys组与3% NaCl组的磷酸化水平无显著差异（P＞0.05），条带1、2、3、7、8、10、15、16的1% NaCl＋0.06%L-Lys组较3% NaCl组的磷酸化水平显著降低（P＜0.05）。同时，条带4、5、8、10、11、12的3% NaCl＋0.06%L-Lys组较3% NaCl组的磷酸化水平差异不显著（P＞0.05），条带1、6、9、13、14、16的3% NaCl＋0.06%L-Lys组较3% NaCl组的磷酸化水平显著提高（P＜0.05），这可能是由于L-Lys与NaCl之间存在互作关系，对于大部分条带而言，当NaCl添加量达到3%时，添加0.06%L-Lys并不能继续显著降低鸡腿肉的肌原纤维蛋白磷酸化水平甚至会提高磷酸化水平。不同处理组的各条带与肌原纤维蛋白整体磷酸化水平变化并不完全一致，说明NaCl与L-Lys的添加对于单个蛋白磷酸化水平的影响具有差异性。

2.2 磷酸化差异蛋白条带质谱鉴定

选择16 条磷酸化差异显著的条带进行质谱鉴定，结合UniProtKB数据库中给出的蛋白信息，筛选出的蛋白结果如表3所示，鉴定出的蛋白主要包括3 类，涉及到肌肉收缩、糖酵解过程以及离子运输等有关的蛋白。其中出现了肌浆蛋白的主要成分，主要是由于某些糖酵解酶与肌原纤维蛋白中的原肌球蛋白、肌动蛋白等有很强的结合力，同时，在离心结束后，也会存在一些肌浆蛋白质溶于肌原纤维蛋白沉淀中，难以完全去除[21]。

表3 鸡腿肉肌原纤维蛋白质谱鉴定结果Table 3Identification of myofibrillar proteins in chicken thigh meat by LCMS/MS

注：—.未鉴定。

肌原纤维蛋白质谱鉴定结果表明，1、7、8这3 个条带为未鉴定蛋白，条带2主要是肌球蛋白重链，肌球蛋白重链主要与肌肉收缩等肌节功能有关。肌球蛋白重链的磷酸化通常与轻链磷酸化相互介导，而在一定的生理状态下，肌球蛋白重链发生去磷酸化时，促使肌动球蛋白解离，肌动球蛋白ATPase活性显著降低，最终导致肉品嫩度和保水性下降[22-24]。表2结果显示，添加NaCl后，肌球蛋白重链磷酸化水平均显著提高（P＜0.05），而1% NaCl＋0.06%L-Lys组、3% NaCl＋0.06%L-Lys组的肌球蛋白重链较3% NaCl组的磷酸化水平均显著降低（P＜0.05），相对较低的磷酸化水平会抑制肌球蛋白的降解。条带3主要是M蛋白，它是横纹肌中肌原纤维M带的结构成分，主要与肌动蛋白丝结合，与肌肉收缩有关，可能在肌源纤维结构的维稳中发挥重要作用[25]。而当M蛋白发生磷酸化时，与肌球蛋白的结合力减弱[26]，将加快蛋白降解。添加NaCl后，M蛋白磷酸化水平显著提高（P＜0.05），1% NaCl＋0.06%L-Lys组的M蛋白较1% NaCl组的磷酸化水平显著提高（P＜0.05），3%NaCl＋0.06%L-Lys组的M蛋白较3% NaCl组的磷酸化水平显著降低（P＜0.05），说明低盐条件下添加0.06%L-Lys能够加快蛋白降解，改善肉嫩度，而高盐条件下添加0.06%L-Lys不利于蛋白降解，不利于肉品质。

条带4、11分别为α-辅肌动蛋白-2和肌动蛋白，α-辅肌动蛋白-2存在于肌肉组织中，它可以维持肌原纤维结构的稳定性，与肌肉收缩有关，交联肌动蛋白并参与信号转导过程，进而影响肌动蛋白丝的形成[27]。当α-辅肌动蛋白-2发生磷酸化时，会促进肌肉收缩并不利于肌原纤维结构维稳[28]，1% NaCl ＋0.06%L-Lys组的α-辅肌动蛋白-2磷酸化水平较3% NaCl组显著提高（P＜0.05），3% NaCl＋0.06%L-Lys组较3% NaCl组的α-辅肌动蛋白-2磷酸化水平无显著差异（P＞0.05），说明低盐条件下添加0.06%L-Lys有利于肌原纤维结构维稳。肌动蛋白是一种高度保守的蛋白质，其参与各种类型的细胞运动并且在所有真核细胞中普遍表达。1% NaCl＋0.06%L-Lys组的肌动蛋白磷酸化水平较1% NaCl组、3% NaCl组均显著提高（P＜0.05），而当肌动蛋白磷酸化程度升高时，不易被钙蛋白酶降解，同时保水性也会降低[29-30]。

条带5、13为肌浆/内质网钙ATP酶1和电压依赖性阴离子通道。肌浆/内质网钙ATP酶1是一种主要的Ca2＋转运酶，负责将细胞溶质中的Ca2＋重新转运到内质网并催化ATP的水解，它有助于肌肉激发或收缩过程中涉及的钙螯合[31]。各处理组的肌浆/内质网钙ATP酶1磷酸化水平无显著差异（P＞0.05），当它发生磷酸化时，催化ATP水解的活性下降[32]。电压依赖性阴离子通道是位于线粒体外膜上的孔状蛋白，也是控制阴离子进出线粒体的重要通道，3% NaCl＋0.06%L-Lys组的电压依赖性阴离子通道磷酸化水平较其他处理组显著提高（P＜0.05），当它发生磷酸化时，能够干扰ADP的运输和ATP生物合成[33]。

已有研究发现，当糖酵解相关的酶发生磷酸化时，会影响酶的活性，如6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶发生磷酸化时，酶活性提高，促进糖酵解过程，影响肉的pH值变化进而影响肉的僵直过程，不利于提高肉品质[34]。条带6、9、10主要为6-磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶、β-烯醇化酶等参与糖酵解过程的酶，1% NaCl＋0.06%L-Lys组的丙酮酸激酶与3% NaCl组的低磷酸化水平差异不显著（P＞0.05），1% NaCl＋0.06%L-Lys组的β-烯醇化酶较1% NaCl组和3% NaCl组的磷酸化水平均显著降低（P＜0.05），表明低盐条件下添加0.06%L-Lys可以通过降低部分糖酵解酶的磷酸化水平达到提高肉品质的目的。

条带12、14、15和16主要是原肌球蛋白α-1链、肌球蛋白轻链1、肌球蛋白轻链2和肌球蛋白轻链3。原肌球蛋白α-1链是一种细肌丝相关蛋白，当它发生磷酸化时，有助于调节应激纤维的形成[35]，促进细胞骨架的重构[36]，肌球蛋白是细胞骨架的主要成分，当肌球蛋白轻链发生磷酸化时，会影响加快骨骼肌收缩频率[37]，诱导平滑肌收缩，影响细胞的主要活动等生理过程[38-39]，且肌球蛋白轻链2磷酸化的程度与肌肉收缩力增强程度呈正比[40]，相对较低的磷酸化水平更容易被钙蛋白酶降解，有利于肉品嫩度的提高。1% NaCl＋0.06%L-Lys组的原肌球蛋白α-1链、肌球蛋白轻链2、肌球蛋白轻链3较1% NaCl组的磷酸化水平显著降低（P＜0.05），1% NaCl＋0.06%L-Lys组的肌球蛋白轻链2和肌球蛋白轻链3较3% NaCl组的磷酸化水平显著降低（P＜0.05），说明低盐条件下添加0.06%L-Lys可以促进蛋白降解。

3 结 论

在1% NaCl条件下添加0.06%L-Lys降低鸡腿肉肌原纤维蛋白的整体磷酸化水平，并与3% NaCl的整体磷酸化水平无显著差异（P＞0.05）。在3% NaCl处理组中添加0.06%L-Lys较3% NaCl组的整体磷酸化水平无显著差异（P＞0.05），并显著提高了6-磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶、肌球蛋白轻链1、肌球蛋白轻链3的磷酸化水平（P＜0.05），表明0.06%L-Lys的添加并不随着NaCl用量的提高而显著影响蛋白的磷酸化水平（P＞0.05）。与3% NaCl组相比，0.06%L-Lys在1% NaCl条件下显著降低肌球蛋白重链、β-烯醇化酶、肌球蛋白轻链2、肌球蛋白轻链3磷酸化水平（P＜0.05）。L-Lys的添加有可能通过对肌原纤维蛋白磷酸化水平产生的正面效应，进而促进钙蛋白酶对蛋白的降解，影响肌肉收缩和宰后僵直成熟过程，为降低肉品中NaCl用量的同时正向调控肉品质提供理论基础。