冰片配伍黄芪甲苷和三七总皂苷对脑缺血/再灌注损伤后神经血管单元的保护作用

欧阳波，杨筱倩，丁 煌，刘晓丹，黄小平，邓常清

(湖南中医药大学分子病理实验室，中西医结合心脑疾病防治湖南省重点实验室，细胞生物学与分子技术湖南省高校重点实验室，湖南 长沙 410208)

缺血性脑卒中是严重威胁人类生命健康的疾病。以往的神经保护药物都以保护神经元为核心，忽略了神经元、胶质细胞与微血管之间的相互关系[1]，临床疗效与预期结果相差甚远。近年来研究表明[2]，所有的脑细胞及基质成分都参与了脑组织缺血损伤过程，并非只有神经元或血管参与病理反应。因此，美国国家神经疾病和中风学会提出以神经元、微血管及神经胶质细胞为主要成分的神经血管单元(neurovascular unit，NVU)的概念[3]，强调在脑卒中治疗中，通过对 NVU 各成分保护，以减轻脑组织损伤。

中医认为缺血性中风的主要病机是气虚血瘀，益气活血法为其基本治则。黄芪具有补气之功，三七具有活血之效，二者配伍具有益气活血的功效，为治疗心脑血管疾病的常用药对。其中黄芪甲苷(astragaloside Ⅳ，AST Ⅳ)和三七总皂苷(panax notoginseng saponins，PNS)分别为黄芪和三七心脑血管效应的主要药效组分[4]。以往我们研究表明，AST Ⅳ 和 PNS 配伍具有多环节、多靶点抗缺血性脑损伤的作用[5]，但AST Ⅳ 和 PNS 分子量较大、脂溶性低，难以透过血脑屏障(blood brain barrier，BBB)。而冰片具有“引药上行”的作用，可促进药物透过BBB。我们将冰片配伍AST Ⅳ 和 PNS，可促进AST Ⅳ 和 PNS 的药物成分在缺血/再灌注侧大脑皮层富集[6]。推测冰片配伍AST Ⅳ 和 PNS 可能对 NVU 的各组分具有保护作用。本文从 NVU 保护探讨冰片配伍AST Ⅳ 和 PNS 对大鼠脑缺血/再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)后 NVU 的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物SPF 级 SD 大鼠，♂，体质量(220～250) g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物生产合格证号为 No 43004700037715。饲养于湖南中医药大学动物实验中心(场地许可证号: SKY(湘)2013-0005)。实验前适应性喂养(5～7)d，给药前禁食 12 h，自由饮水。动物的使用符合科技部《关于善待实验动物的指导性意见》相关规定。

1.2 主要药物冰片(左旋龙脑，主要成分为 1,7-三甲基-二环庚-2-醇，含量 86%，购自湖北俊辉有限公司，批号 20170815)；AST Ⅳ(纯度 ≥ 98%，批号 MUST-17022804)、PNS(纯度 ≥ 98%，批号 MUST-17060601)均购自成都曼思特生物科技有限公司，用时以 0.5% 羧甲基纤维素钠配成混悬液；依达拉奉注射液(3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5 酮)购自南京先声东元制药有限公司生产，批号 80-090104，规格10 mg/支(5 mL)，用时以生理盐水配成 0.4 g·L-1溶液备用。

1.3 主要试剂兔抗大鼠神经元特异性核蛋白(neuron specific nuclear，NeuN)多克隆抗体(批号A0951)、兔抗大鼠 Laminin(LN)多克隆抗体(批号A9872)、兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillary acidic protein，GFAP)单克隆抗体(批号A0237)、兔抗大鼠 β-actin 多克隆抗体(批号AC026)均购自美国ABclonal 公司；兔抗大鼠基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)多克隆抗体(批号 ab38898)、兔抗大鼠水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP-4)多克隆抗体(批号 ab46182)均购自英国Abcam 公司；HRP 标记的山羊抗兔二抗(美国Proteintech 公司，批号 SA00001-2)。ECL 化学发光液(北京鼎国昌盛生物科技有限公司，批号 GE2301)、蛋白 Marker(美国 Thermo-fisher，批号 515683)、BCA 蛋白定量试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号 K176810E)、通用型二步法试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号 PV-9000)、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium hloride，TTC)(美国 Sigma 公司，批号 C10654018)。

1.4 仪器BX51 光学显微镜(日本 Olympus)，RM2235 石蜡切片机(德国 Leica)，Chemi-DoC XRS+化学发光成像分析仪(美国 Bio-Rad)，ELX800 多功能酶标仪(美国 biotek)，041BR132283 电泳/转膜装置(美国 Bio-Rad)。

2 方法

2.1 动物分组与给药根据以往研究[7]，将动物随机分为假手术组、模型组、冰片(7.5 mg·kg-1)组、AST Ⅳ(10 mg·kg-1)组、PNS(25 mg·kg-1)组、AST Ⅳ+PNS(AST Ⅳ 10 mg·kg-1+PNS 25 mg·kg-1)组、低剂量(冰片 7.5 mg·kg-1+AST Ⅳ 10 mg·kg-1+PNS 25 mg·kg-1)组、高剂量(冰片 15 mg·kg-1+AST Ⅳ 20 mg·kg-1+PNS 50 mg·kg-1)组、依达拉奉(4 mg·kg-1)组。各组于造模前 3 d灌胃给药，每日 2 次，同时腹腔注射等量生理盐水。依达拉奉组腹腔注射给药，同时灌胃等量 0.5% 羧甲基纤维素钠，每日2次。假手术组与模型组以 0.5% 羧甲基纤维素钠 10 mL·kg-1剂量灌胃给药，同时腹腔注射等量生理盐水，每日2次。末次给药后2 h造模。缺血2 h后进行再灌注，再灌注期间同前给药，再灌注22 h 进行检测。

2.2 右侧大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)法制备CIRI 模型 按以往方法[6]制作线栓法 MCAO 局灶性脑缺血模型，阻断2 h后，拔出线栓进行再灌注22 h。假手术组不做插线处理，其他操作同模型组。各组纳入 Bederson 评分[8]为 1～3 分的大鼠，剔除评分为 0 分或 4 分的大鼠。

2.3 检测指标

2.3.1神经功能缺损评分 采用盲法对各组进行 Garcia评分[9]，从大鼠自主运动、体态对称性、前肢伸展功能、网屏实验、身体双侧触觉、双侧胡须反射等 6 个方面评定神经功能损伤程度，功能正常时得分最高(18 分)，功能损伤最严重者得分最低(3 分)。

2.3.2脑梗死体积测定 麻醉，断头取脑，去除小脑和脑干，-20 ℃ 冷冻 30 min 后将脑组织制成厚度为 2 mm 的冠状切片。将脑片置于 4% TTC 液中 37 ℃ 避光孵育 30 min， 然后以 4% 多聚甲醛固定 24 h 后拍照。用 Image J 图像分析软件计算脑梗死区(苍白区)面积，将各脑片梗死面积与厚度的乘积累加，获得梗死体积。计算梗死体积百分率：梗死体积百分率/%=梗死区体积/正常侧大脑半球体积 ×100 %。

2.3.3免疫组织化学法检测GFAP、NeuN、LN 蛋白表达 脑组织置 4% 多聚甲醛固定48 h，石蜡包埋，自视交叉后行冠状切片，层厚5 μm。常规脱蜡、脱水；置枸橼酸钠缓冲液中微波抗原修复20 min，冷却至室温，PBS漂洗3次，每次5 min，山羊血清封闭 30 min；再分别加兔抗大鼠 GFAP 抗体(1 ∶ 400)、兔抗大鼠 NeuN 抗体(1 ∶ 400)、兔抗大鼠 LN 抗体(1 ∶ 400)，4 ℃ 孵育过夜；PBS 漂洗，滴加 HRP 标记的二抗，37 ℃ 孵育 1 h, PBS 漂洗, DAB 显色，苏木精复染，自来水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树脂封片。光学显微镜下观察缺血侧海马CA1区，GFAP 阳性染色可见棕黄或棕褐色免疫反应产物沉积于星形胶质细胞胞质，NeuN 阳性染色可见棕黄或棕褐色免疫反应产物沉积于神经元胞质、突起，LN 阳性染色可见棕黄或棕褐色免疫反应产物沉积于血管内皮基底膜。每只大鼠随机取 3 个不重叠高倍视野(× 400)拍照，用 Image J 图像分析系统分别计数 GFAP、NeuN、LN 阳性表达的平均光密度(Mean density, MD)，代表目的蛋白的相对表达量。

2.3.4Western blot 检测AQP-4、MMP9蛋白的表达 取患侧视交叉后 2～6 mm 脑组 50 mg，提取总蛋白，BCA 法测定总蛋白量。每个样本取 80 μg 蛋白，100 ℃水浴 10 min 变性，SDS-PAGE 电泳90 min，200 mA 转膜2 h，5% 脱脂牛奶封闭1 h，分别加入兔抗大鼠 MMP-9 抗体(1 ∶ 1 000)、兔抗大鼠AQP-4 抗体(1 ∶ 1 000)，兔抗大鼠 β-actin 抗体(1 ∶ 8 000) 4 ℃ 孵育过夜，TBST 洗膜3次；再分别加山羊抗兔二抗(1 ∶ 5 000)，37 ℃ 孵育 1 h，TBST 洗膜3次后加 ECL 化学发光剂显影。用 Image Lab 图像分析软件测定目的条带的积分光密度值(integral optical density, IOD)，以目的条带的 IOD 与 β-actin 条带 IOD 的比值作为该目的蛋白相对表达量。

3 结果

3.1 冰片配伍AST Ⅳ和PNS对神经功能的影响假手术组大鼠神经功能正常，行为学评分为 16～18 分。与假手术组比较，模型组大鼠表现自主运动减少、身体扭曲、左前爪不能完全伸展、左前爪脱网、触觉减弱、胡须反射减少等神经功能障碍症状，神经功能评分明显低于假手术组(P<0.01)；与模型组比较，PNS 组、AST Ⅳ+PNS 组及低剂量组、高剂量组、依达拉奉组神经功能评分明显升高(P<0.05 和P<0.01)；与AST Ⅳ+PNS 组比较，低剂量组、高剂量组和依达拉奉组神经功能评分明显升高(P<0.05 和P<0.01)(Tab 1)。

Tab 1 The Garcia J H neurological function scores of each group n=5)

3.2 冰片配伍AST Ⅳ和PNS对脑梗死体积的影响TTC 染色显示，假手术组无苍白梗死区。与假手术组比较，模型组梗死体积明显增加(P<0.01)；与模型组比较，冰片组、AST Ⅳ 组、PNS 组、AST Ⅳ+PNS 组、低剂量组、高剂量组、依达拉奉组脑梗死体积明显减少(P<0.01)；与AST Ⅳ+PNS 组比较，低剂量组、高剂量组、依达拉奉组脑梗死体积明显降低(P<0.05)(Fig 1)。

Fig 1 Volume of cerebral infarction

3.3 冰片配伍AST Ⅳ和PNS对脑组织GFAP、NeuN、LN 表达的影响 与假手术组比较，模型组 GFAP 表达明显增加(P<0.01)；与模型组比较，PNS 组、AST Ⅳ+PNS 组、低剂量组、高剂量组、依达拉奉组 GFAP 表达均明显减少(P<0.05和P<0.01)；与AST Ⅳ+PNS 组比较，低剂量组、高剂量组、依达拉奉组 GFAP 表达明显减少(P<0.01)；低剂量组、高剂量组 GFAP 表达组间差异无统计学意义(P>0.05)(Fig 2)。

与假手术组比较，模型组 NeuN 表达明显减少(P<0.01)；与模型组比较，冰片组、AST Ⅳ 组、PNS 组、AST Ⅳ+PNS 组、低剂量组、高剂量组、依达拉奉

Fig 2 Expression of GFAP

组 NeuN 表达明显增加(P<0.01)；与AST Ⅳ+PNS 组比较，低剂量组、高剂量组、依达拉奉组 NeuN 表达明显增加(P<0.01)；低剂量组、高剂量组 NeuN 表达组间差异无统计学意义(P>0.05)(Fig 3)。

与假手术组比较，模型组 LN 表达明显减少(P<0.01)；与模型组比较，冰片组、AST Ⅳ 组、PNS 组、AST Ⅳ+PNS 组、低剂量组、高剂量组、依达拉奉组 LN 表达明显增加(P<0.05，P<0.01)；与AST Ⅳ+PNS 组比较，高剂量组、依达拉奉组 LN 表达明显增加(P<0.01)；低剂量组、高剂量组 LN 表达组间差异无统计学意义(P>0.05)(Fig 4)。

3.4 冰片配伍AST Ⅳ 和 PNS 对脑组织AQP-4、MMP9 表达的影响与假手术组比较，模型组AQP-4 表达明显增加(P<0.05)；与模型组比较，低剂量组、高剂量组AQP-4 表达明显降低(P<0.05)；与AST Ⅳ+PNS 组比较，高剂量组AQP-4 表达明显降低(P<0.05)；低剂量组、高剂量组AQP-4 表达组间差异无统计学意义(P>0.05)。

Fig 3 Expression of NeuN in each group n=5)(× 400, bar=20 μm)

与假手术组比较，模型组MMP-9表达明显增加(P<0.01)；与模型组比较，高剂量组MMP-9 表达明显降低(P<0.05)；与AST Ⅳ+PNS 组比较，低剂量组、高剂量组MMP-9表达明显降低(P<0.05)；低剂量组、高剂量组 MMP-9 表达组间差异无统计学意义(P>0.05)(Fig 5)。

4 讨论

CIRI 是一个多因素、多细胞介导的病理损伤过程，兴奋毒性、细胞内 Ca2+超载、自由基损伤、炎症反应等可导致神经元和血管内皮受损，BBB 通透性增加，同时小胶质细胞和星形胶质细胞激活，释放大量细胞因子及炎症介质，引起神经元、血管内皮细胞和胶质细胞损伤，从而加重脑损伤[10]。NVU 是中枢神经系统的结构和功能单元，由神经元、胶质细胞、内皮细胞等组成。NVU 作为一个整体结构，对维持脑结构及功能的正常具有重要作用。目前认为，单一的神经元保护药物对缺血性脑损伤保护作用有限，因此，从 NVU 各成分的保护是缺血性脑卒中的重要治疗策略[11]。

Fig 4 Expression of Laminin in each group n=5)(× 400, bar=20μm)

神经元是 NVU 的基本单位和核心成分，NeuN 是成熟神经元细胞核的特异标记物，其表达降低可反映成熟神经元的损伤[1]。星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多的胶质细胞，不仅参与 NVU 的组成，还为神经元提供结构和营养支持。脑缺血时星形胶质细胞激活呈“双刃剑”作用，早期分泌神经营养因子，延迟神经元死亡；晚期释放炎症因子和神经毒性分子，引起神经元继发性损伤[1]。GFAP是星形胶质细胞特异性分子标志，反映星形胶质细胞的活化[12]。微血管内皮细胞是微血管的基本结构，对维持血管壁结构与功能完整性十分重要。脑缺血后，炎症介质可损害脑毛细血管基底膜，破坏血管的完整性，引起BBB通透性增加，导致脑水肿。LN主要存在于微血管基底膜中，检测LN可反映微血管结构完整性[1]。因此，NeuN、GFAP及LN能够较好地反映NVU的主要成分(神经元、星形胶质细胞和微血管)在CIRⅠ后的病理损伤。本研究表明，AST Ⅳ和PNS配伍可改善脑缺血/再灌注后神经功能障碍，缩小脑梗死体积，减轻脑水肿，具有抗缺血性脑损伤的作用。冰片配伍AST Ⅳ和PNS后其作用增强，呈现增效作用。对NVU主要成分的分析表明，AST Ⅳ和PNS配伍可抑制脑缺血/再灌注后GFAP表达，促进NeuN和LN表达，冰片配伍AST Ⅳ和PNS后作用增强。提示AST Ⅳ和PNS可抑制脑缺血/再灌注后脑组织星形胶质细胞过度活化，抑制缺血导致的神经元和血管内皮细胞损伤，对脑缺血后NVU具有保护作用。

Fig 5 Expression of AQP-4 and MMP-9 protein in brain tissues of each group n=5)

CIRI后缺血缺氧可以引起脑组织水肿。脑水肿可分为细胞源性脑水肿和血管源性脑水肿，前者是星形胶质细胞水肿引起的，后者是BBB功能障碍导致的。AQP-4主要表达在星形胶质细胞，其表达增加可介导水分子进入星形胶质细胞，引起胶质细胞水肿[14]，AQP-4表达增加可以反映星形胶质细胞的活化。MMP-9是基质金属蛋白酶家族的主要成员之一，其在脑血管基底膜的降解中起重要作用。在正常脑组织内，MMP-9只有低水平的表达；CIRI后，在缺氧、炎性反应等因素的促发下，MMP-9激活，降解脑血管基底膜的LN、纤维联接蛋白、Ⅳ型胶质蛋白等成分，改变BBB通透性，从而引起血管源性脑水肿[15]。因此，MMP-9的水平可以反映微血管的损伤情况。本研究表明，冰片配伍AST Ⅳ和PNS后可抑制AQP-4和MMP-9表达。表明冰片配伍AST Ⅳ和PNS在保护NVU的同时，可能通过下调AQP-4的表达，抑制水分子流入星形胶质细胞，减轻细胞源性脑水肿的形成。并且冰片配伍AST Ⅳ和PNS可抑制MMP-9表达，可能减轻脑微血管基底膜损伤，保护BBB，抑制血管源性脑水肿的形成。

总之，冰片与AST Ⅳ、PNS配伍后，具有抑制星形胶质细胞过度活化、减轻神经元和微血管基底膜的损伤、减轻脑水肿的作用，具有比AST Ⅳ配伍PNS更好的NVU保护作用。但冰片与AST Ⅳ、PNS配伍保护NVU的具体作用机制有待进一步阐明。