基于网络药理学的济生肾气丸治疗骨质疏松症的分子机制研究

傅繁誉 黄泽青 孙继高 王荣田 叶恒力 陈卫衡*

1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550002 2.中国中医科学院望京医院，北京 100102 3.北京中医药大学第三附属医院，北京 100029

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是以骨量减少，骨微观结构的退化为主要特征，容易发生脆性骨折的一种全身性骨骼疾病[1]。随着人口老龄化的加剧，其患病率正在逐年上升，已成为许多国家的主要公共卫生问题[2]。尽管目前我国因骨质疏松症导致的骨折发病率、致残率及死亡率都较高，然而患者的有效治疗率却偏低[3]。目前临床上对于OP的治疗主要采取药物治疗，包括以化学药为主的骨吸收抑制剂、骨形成促进剂和骨矿化药物三类[4]。

济生肾气丸源自宋·严用和《济生方》[5]。以“肾主骨”为指导，全方具有补肾壮骨、健脾益气之功效。有研究[6]表明济生肾气丸能明显提高骨质疏松症模型大鼠血清雌二醇、骨钙素及降钙素水平。但济生肾气丸治疗骨质疏松症的作用机制尚未完全明确，故本研究采用网络药理学方法，对济生肾气丸多成分、多靶点、多通路与骨质疏松症的复杂网络关系进行分析，旨在揭示济生肾气丸治疗骨质疏松症的作用机制，为进一步实验验证济生肾气丸作用机制提供新靶点。

1 材料和方法

1.1 济生肾气丸活性成分的收集与筛选

本研究通过中药系统药理学分析平台(http://tcmspw.com/tcmsp.php)以“熟地黄”、“山茱萸”、“牡丹皮”、“山药”、“茯苓”、“泽泻”、“肉桂”、“附子”、“牛膝”、“车前子”十味中药成分作为Herb name检索，利用口服生物利用度(OB)和类药性(DL)为筛选指标，选择OB≥30%，DL≥0.18为符合条件的活性成分，通过TCMSP数据库获取济生肾气丸活性成分所对应的靶点，输入到Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)中获得药物靶点的标准基因名称。

1.2 方法

1.2.1骨质疏松症靶标基因的获取：通过CTD(https://www.thefreedictionary.com)、GeneCards(https://www.genecards.org)、OMIM(https://www.omim.org)三个数据库以“osteoporosis”为关键词搜索骨质疏松症相关靶标基因。

1.2.2交集靶点的获取：利用Venny 2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在线工具绘制济生肾气丸相关活性成分靶点和骨质疏松症靶点的韦恩图，获得其交集靶点，探究济生肾气丸的有效成分对骨质疏松症靶点的靶向作用。

1.2.3活性成分-交集靶点网络的构建及拓扑分析：通过Cytoscape 3.6软件构建活性成分-交集靶点相互作用网络，中药成分或靶点表示为网络之中的节点，他们之间的联系表示为边，使用Cytoscape 3.6软件中Net-work Analyzer计算连接度(Degree)参数来评价药效成分和靶点的重要性。

1.2.4构建蛋白相互作用(PPI)网络：将获得的交集靶基因输入String数据库(http：//string-db.org)，设置物种为“Homo sapiens”，选取置信度高于0.7的数据，获得交集基因对应的蛋白互作信息，然后导入Cytoscape软件中利用CytoHubba插件对其进行蛋白互作分析。

1.2.5DAVID富集分析：将获得的交集基因输入到DAVID数据库(https：//david.ncifcrf.gov/)进行基因本体(GO)生物过程富集分析和KEGG通路富集分析(p.adjust<0.05)，将富集度高的前10名GO和前20名KEGG通过R-studio软件用气泡图的形式展现出来。

1.2.6构建核心靶点-通路网络图：将获得的交集基因与前20名KEGG导入cytoscape 3.6软件构建核心靶点与通路的相互作用网络图，图形的大小代表连接节点的数目，选择明显调控通路的基因进行基因-通路网络分析，筛选出济生肾气丸治疗骨质疏松症的关键靶点。

2 结果

2.1 济生肾气丸活性成分

在TCMSP数据库中检索济生肾气丸各药物活性成分，满足OB≥30%和DL≥0.18，最后获得63个活性成分。部分结果见表1。

表1 济生肾气丸部分活性成分Table 1 Some active ingredients in Jisheng Shenqi Pill

2.2 济生肾气丸活性成分的靶点预测及骨质疏松症的靶点挖掘

通过TCMSP数据库得到济生肾气丸活性成分靶点211个，经过三个数据库(CTD)、(GeneCards)、(OMIM)共检索出OP相关靶点3 126个，通过Venny 2.1将成分靶点与疾病靶点取交集，得到132个共同靶点，这132个共同靶点视为济生肾气丸治疗骨质疏松症可能的潜在靶点。见图1。

图1 成分靶点与疾病靶点取交集后的韦恩图Fig.1 Venn diagram after the intersection of the component target and the disease target

2.3 济生肾气丸活性成分-交集靶点相互作用网络

将济生肾气丸的活性成分与交集靶点关系导入Cytoscape 3.6软件，绘制济生肾气丸活性成分-交集靶点的网络关系，得到了一个包含192个点和386条边的网络。图中蓝色长方形为132个交集基因，圆圈代表各个药物，蓝色代表车前子，浅紫色代表茯苓，灰色代表附子，深紫色代表牡丹皮，浅绿色代表牛膝、深绿色代表山药、粉色代表山茱萸，黄色代表泽泻，红色代表多种药物，见图2。由此可见济生肾气丸是以多成分-多靶点-多途径的形式来治疗骨质疏松症的，体现了济生肾气丸治疗OP作用机制的系统性与复杂性。根据连接度值(degree)大小排列，其中槲皮素(Quercetin)、山柰酚(Kaempferol)、汉黄芩素(Wogonin)的连接度值位于前三名，分别为98、37、28，是与交集靶点连接较紧密的活性成分，表明这3个成分可能是济生肾气丸治疗OP的重要核心活性成分，具有重要意义。

图2 济生肾气丸有效成分-交集靶点网络分析Fig.2 Analysis of the active ingredient-intersection target network of Jisheng Shenqi pill

2.4 蛋白相互作用(PPI)网络分析

将济生肾气丸与骨质疏松症交集靶点导入String数据库中，获得交集蛋白相互作用关系，去掉无连接的蛋白，再将获得的蛋白互作用关系导入Cytoscape软件中利用CytoHubba插件根据degree值进行网络图的构建，该网络由122个节点与915条边构成，见图3。图中圆形节点表示单个基因蛋白，节点之间的连线代表2个蛋白有相互作用关系，线越多代表作用关系越强，图形的大小、颜色由浅变红映射degree值由小变大，根据结果得到：AKT1、MAPK1、MAPK8、IL6、JUN、VEGFA等基因排名靠前，可能为济生肾气丸治疗OP的核心靶点。

图3 蛋白相互作用关系图Fig.3 Protein interaction diagram

2.5 DAVID富集分析

采用DAVID在线数据库进行GO和KEGG通路分析，济生肾气丸可影响基因本体(gene ontology，GO)生物学过程2 127个，其中生物过程(biological process，BP)1 945个，细胞组成(cellular component，CC)55个，分子功能(molecular function，MF)127个；京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)代谢通路147条。如图4所示，在生物学过程(BP)中富集显著度较高的是对有毒物质的反应，对细胞外刺激的反应，对氧化应激的反应，对营养水平的反应等；在细胞组成(CC)中富集显著度较高的是膜微区、膜区域、核染色体部分、核染色质等；在分子功能(MF)中富集显著度较高的是DNA结合转录激活因子活性、RNA聚合酶II近端启动子序列特异性DNA结合、血红素结合、核受体活性等。通过KEGG分析得到148条富集通路，图5为富集程度最高的前20条代谢通路。主要涉及肿瘤坏死因子信号通路、白细胞介素17信号通路、AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路等，表明济生肾气丸可能通过作用于这些通路起到治疗OP的作用。

图4 GO富集分析气泡图Fig.4 Bubble chart of GO enrichment analysis

图5 通过KEGG分析得到济生肾气丸治疗OP作用预测靶点通路Fig.5 Prediction of target pathways for the effect of Jisheng Shenqi Pills on OP by KEGG analysis

2.6 核心靶点-通路网络图分析

构建核心靶点-通路网络图基于显著富集的通路和调控这些通路的基因，如图6所示。对前20条通路和81个与前20条通路有关系的基因根据连接节点的数目(degree)进行了分析，黄色正方形代表目标基因，V形代表前20条通路。从结果中得知，AKT1的degree值最大，是核心靶基因。其他几个基因也有较大的degree，如MAPK1、MAPK8、JUN、IL6、VEGFA等，他们可能是济生肾气丸治疗OP的核心靶点。

图6 核心靶点-信号通路相互作用网络图Fig.6 Core target-signal pathway interaction network diagram

3 讨论

网络药理学是多学科交叉互接，应用整体生物网络的分析，揭晓药物与靶点之间的相互关系，解释中药活性成分之间的协同作用机制[7]。把网络药理学的思想与方法融入进中药药理研究中，阐释中药治疗疾病的作用机制，能更好的推动骨质疏松症的防治[8]。骨质疏松症的发病机制与脾、肝、肾三脏之间的关系紧密[9]。其中脾虚失其健运，气血生化乏源致四肢不荣是骨质疏松症发病的重要因素；肝失疏泄，藏血渎职，筋脉失其所养是骨质疏松症发病的重要病因；肾精亏虚、天癸衰竭、骨骼失养则是骨质疏松症发病的直接原因[10]。济生肾气丸由“熟地黄”、“山茱萸”、“牡丹皮”、“山药”、“茯苓”、“泽泻”、“肉桂”、“附子”、“牛膝”、“车前子”十味药组成，方中熟地黄具有滋补肾阴之效，佐以肉桂、附子助命门之火而温阳化气，有“阴中求阳”之意；山茱萸、山药联合运用可补肝益脾，生精化血；牛膝滋阴益肾，泽泻、茯苓功可利水渗湿，可防地黄滋腻之弊；牡丹皮清肝泄热，车前子清热利湿，四药功用为补中寓泻[11]。

本研究发现济生肾气丸治疗OP的主要核心活性成分为槲皮素(Quercetin)、山柰酚(Kaempferol)、汉黄芩素(Wogonin)等。Yuan等[12]研究发现槲皮素增加了绝经后骨质疏松大鼠的骨密度，改善了骨的生物力学性能，还能促进骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化。Konar等[13]通过研究证实了槲皮素对BMP-2的结构和构象有显著影响，表明槲皮素是一种潜在的治疗绝经后骨质疏松症的治疗方法。山柰酚通过促进成骨细胞形成来预防去卵巢诱导的大鼠骨质疏松症，使大鼠骨髓间充质干细胞的矿化作用增强，ALP活性升高、Runx-2和Osterix表达水平升高、p-S6K表达水平升高、p-4E/BP1表达水平降低，与其促进成骨细胞分化的能力一致[14]。山柰酚能通过抑制脂肪生成、炎症、氧化应激、破骨细胞自噬和成骨细胞凋亡，激活成骨细胞自噬，达到骨保护作用，因此对骨质疏松症的预防和治疗有潜在的效果[15]。汉黄芩素通过抑制NFATc1从细胞质向细胞核的转运，从而抑制与破骨细胞分化相关基因的下调，且抑制了破骨细胞的分化，表明汉黄芩素是一种潜在的治疗骨质疏松症的药物[16]。

本研究通过蛋白互作用网络与核心靶点-通路图的结果提示济生肾气丸作用于OP的关键靶点涉及AKT1、MAPK1、JUN、MAPK8、IL6、VEGFA等。Zhang等[17]研究发现AKT1(丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶)与成骨细胞分化、破骨细胞形成有着密切联系，可作为骨质疏松症的治疗靶点。研究表明AKT1是成骨细胞中一个独特的信号传导媒介，它可以控制成骨细胞和破骨细胞的分化[18]。Zhang等[19]在基因网络分析中发现AKT1等基因都与骨密度存在密切的联系。MAPK8、MAPK1是MAP激酶家族的成员，参与多种细胞过程，如增殖、分化、转录调控和发育等。研究发现骨髓间充质干细胞衍生的外泌体通过MAPK促进成骨细胞增殖，从而改善骨质疏松症[20]。MAPKs可以控制各种细胞活动，包括基因表达、分化、细胞存活和凋亡，特别是在调节炎症和免疫反应中起重要作用，研究表明MAPKs在破骨细胞中的激活和对胞吐作用的抑制是糖尿病骨质疏松症的主要原因[21]。此外，研究发现活化的MAPK在促进成骨细胞的生成、减少破骨细胞分化以及改善OP方面具有重要意义[22-23]。c-Jun氨基端激酶(其蛋白为JUN)与成骨细胞的增殖和破骨细胞的分化、成熟和功能有着密切的联系，在维系骨形成和骨吸收之间的动态平衡中有着重要作用[24]。Ji等[25]探讨IL-6(白细胞介素6)基因四种单核苷酸多态性与骨质疏松易感性的关系时发现rs1800796基因与IL-6的C等位基因rs2069849的相互作用均与增加骨质疏松症风险有关。Lin等[26]发现白细胞介素6多效性的细胞因子对骨重建至关重要。VEGFA(血管内皮生长因子A)被认为同时支持血管生成和成骨细胞功能，这两个过程是体内骨形成所必需条件之一，VEGFA还能以剂量依赖的方式促进体外成骨细胞的存活、分化和矿化[27]。

根据KEGG通路分析提示济生肾气丸治疗OP相关通路涉及肿瘤坏死因子信号通路、白细胞介素17信号通路、AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路等。肿瘤坏死因子(TNF)具有脂质代谢、凝血、胰岛素抵抗、内皮功能等作用，TNF可刺激破骨细胞的分化，抑制成骨细胞的祖细胞聚集。TNF还可促进RANKL的产生，并与RANKL协同促进破骨细胞分化作用，与RANKL诱导的信号转导通路整合，促进破骨细胞吸收[28]。炎症反应亦是绝经后骨质疏松症(POP)重要的病理生理过程，有研究发现POP患者血清中白细胞介素17(IL-17)水平越高反而骨密度越低，进而提示IL-17可能通过影响骨密度来参与POP的发病过程，通过降低POP患者体内增加的IL-17水平可能对其治疗及预后有重要的临床意义[29]。AGE-RAGE信号通路存在于许多疾病中，晚期糖基化终产物(AGEs)与AGEs受体(RAGE)相互作用，对骨细胞代谢和功能改变有重要作用。一些糖尿病骨病患者的临床结果，如骨密度降低、骨转换标志物抑制和骨质量损害，可能是由于AGE-RAGE信号通路的影响[30]。AGE-RAGE的相互作用会导致氧化应激的产生，进而引发多种细胞的炎症和凝血反应，加重骨质疏松症等疾病的进展，结果表明抑制AGE-RAGE引起的氧化应激的产生可能是一个新的治疗靶点[31]。流体剪切应力(FSS)可诱导内质网(ER)钙快速释放，产生钙瞬变，在成骨细胞增殖和分化中起重要作用，此研究阐明了FSS诱导的成骨细胞增殖与钙瞬变的大小有关，而钙瞬变又进一步激活了能量代谢信号通路[32]。动脉粥样硬化(Atherosclerosis)和骨质疏松症是相互关联的实体，具有相似的致病机制[33]。最近有研究[34]表明骨代谢的关键蛋白，如骨保护蛋白(osteoprotegerin，OPG)和骨桥蛋白(osteopontin，OPN)也参与血管粥样硬化和钙化。

综上所述，济生肾气丸治疗OP具有多靶点、多途径、多通路的特点，也体现了中医学的辨证论治与整体观念，基于网络药理学分析药物与疾病的相互关系能有效的揭示济生肾气丸治疗OP的可能机制。济生肾气丸治疗OP结果表明：济生肾气丸活性成分可能通过作用于AKT1、MAPK1、IL6、MAPK8、JUN、VEGFA等关键靶标基因，调控肿瘤坏死因子信号通路、白细胞介素17信号通路、AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化信号通路等发挥其临床功效，达到治疗OP的目的。由于本研究主要基于数据库信息的提取，虽然使用多个数据库进行综合分析，但仍可能与济生肾气丸发挥作用的实际过程存在一定的区别，下一步需要通过动物模型实验和细胞生物学实验进行验证。