中温条件下添加磁铁粉对麦秆厌氧发酵特性的影响

冉薛伶,曾瑞媛,王燕子，王彦博，王晓娇，任成杰，杨改河，任广鑫

(1.西北农林科技大学 农学院，陕西杨凌 712100；2.陕西省循环农业工程技术研究中心，陕西杨凌 712100；3.扶风县扶风高中，陕西扶风 722200)

秸秆是中国主要农业废弃物，全国秸秆理论资源量为10.4亿t，国家发改委和农业部联合印发的《关于编制“十三五”秸秆综合利用实施方案的指导意见》(发改办环资[2016]2504号)提出到2020年全国秸秆综合利用率要达到85%以上[1]。厌氧发酵(Anaerobic digestion，AD)不仅可以对农业废弃物进行有效处理，同时还可以产生新能源-甲烷，是一种有效处理秸秆的方式。秸秆含有较高的纤维素和碳，利用秸秆进行厌氧发酵效果并不理想[2]，如何利用厌氧发酵高效高产的处理秸秆成为一个热点问题。

Fe元素对厌氧发酵效率以及系统运行稳定性有着重要影响[3-8]。Patel等[9]研究表明，在水葫芦-牛粪的发酵过程中添加FeCl3可以使沼气产量增加60%以上。蔡晓阳等[10]研究表明添加适量的Fe3O4NPs有助于提高大豆蛋白废水厌氧发酵的产气量。汪琪等[11]研究得出适量Fe2+可促进污泥的厌氧发酵。但目前通过添加Fe元素来优化麦秆厌氧发酵效率的研究鲜有报道。本试验在中低温条件下比较添加不同剂量磁铁粉对麦秆厌氧发酵过程中的pH、碱度、甲烷产量、脱氢酶活性(DHA)、纤维素酶活性(CEA)的影响，旨在考察Fe元素在不同温度下对麦秆厌氧发酵特征指标的影响，为秸秆厌氧发酵高产工艺理论研究和生产应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

小麦秸秆来自西北农林科技大学小麦种植地，自然风干后切成2～3 cm小段。发酵接种物取自杨凌示范区崔西沟村正常发酵池的沼液。磁铁粉产自攀枝花市，先将其粉碎并筛分至粒径约 0.5～1.0 mm，然后用超纯水清洗后，在110 ℃烘箱内烘10 h。通过原子吸收光谱法(Hitachi-Z5000，日本)测量磁铁粉特性。发酵原料特性与磁铁粉中金属成分质量占比如表1和表2所示。

表1 发酵原料特性

表2 磁铁粉中金属元素含量

1.2 试验方法

以麦秆为发酵原料，采用Zhang[12]所研究的方法进行批次试验。反应在1 000 mL研磨瓶中进行，其发酵体系物质为700 g(500 g发酵物质和200 g接种物)，总含固率调配成8%。在不同温度(20、25、30、35 ℃)下分别向反应瓶中加入不同剂量磁铁粉0、2、4、6、8 g/L，分别记录为T20、T25、T30、T35和W0、W2、W4、W6、W8。每组试验3个重复。为保证底物均匀混合，每天定时手动摇晃所有发酵瓶1～2 min。

1.3 测量指标

发酵体系含固率(TS)、挥发性固体含量(VS)、总氮(TN)和总碳(TC)、pH、碱度，采用美国公共卫生协会标准方法[13]，测量取样时间为发酵进行的1、6、11、16、21、31、36、41、46、51 d。

采用排水法测定每日产生的沼气体积，并用气体成分分析仪测定甲烷比例(Gasboard-3200p，武汉)。

每5 d测量1次CEA和DHA。纤维素酶活性采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)染色法进行测量并计算出纤维素酶含量[14]。脱氢酶活性通过碘化四硝基氯化物(INT)法进行测量[15]。

1.4 数据处理

利用Excel 2019对数据进行初步整理和计算，采用生态学多变量数据统计分析工具CANOCO 5.0进行冗余分析(Redundancy analysis,RDA)。利用SPSS 26.0进行相关性分析。基于试验得到的累计甲烷产量(M)，用修订的Gompertz模型[16]预测厌氧发酵过程中累计产甲烷潜力(Q)、停滞期(n)、发酵周期(t)等参数，方程表述如下：

M=Q·exp{-exp[R·e·(n-t)/Q+1]}

其中，R为最大日产甲烷生成速率；e是常数，约为2.718 3。

2 结果与分析

2.1 不同磁铁粉添加量对厌氧发酵主要特征指标的影响

2.1.1 对pH的影响 由图1可以看出，发酵体系的pH在不同温度下添加磁铁粉的表现规律是一致的，均表现为下降-升高-保持的趋势。在不同的发酵温度下，添加磁铁粉后，pH表现为前期下降与后期上升速率都很快，说明添加磁铁粉明显有利于厌氧发酵的水解-酸化-产气过程[17]。随着温度升高，pH降至最低点所需的发酵时间减少，且在35 ℃时，pH降至最低点所需的时间最少，表明在该温度下其水解-酸化过程比其他温度下更快。在此过程之后，pH增加到最高点并且趋于稳定。在35 ℃下进行的厌氧发酵，其最高pH达到7.4，明显高于其他温度下的处理，表明较高温度可以促进发酵反应更快更好地进行。在温度为35 ℃时，pH最高值和最低值之前的差值最大，尤其是在添加2 g/L磁铁粉的情况下，pH变化最快。在整个厌氧发酵过程中，不管温度如何变化，对照组的pH总是相对较低，而处理组W2、W6和W8的变化明显。

图1 不同温度下厌氧发酵过程的pH

2.1.2 对碱度的影响 由图2可知，在20～ 35 ℃的发酵条件下，碱度均呈现出先下降后逐渐回升至稳定状态的情况，说明整个发酵体系具备相应的缓冲能力去维持系统稳定[18]，而温度为 35 ℃时，整个发酵过程中碱度保持逐渐上升的趋势。然而，对照组W0的碱度值总是较低，表明其体系稳定性不如处理组，说明加入磁铁粉能提高麦秆发酵系统的缓冲能力，从发酵的第16天碱度开始逐渐上升，最后保持稳定。在发酵开始阶段碱度的组间差异并不明显，当反应稳定之后，由于磁铁粉添加量不同，组间呈现出明显差异。在不同温度下，添加相同剂量的磁铁粉也会产生不同的效果。在温度为25 ℃时，W2和W6的碱度高于W0和W8。而在温度为35 ℃时，W8的碱度值较大,可达1 537 mg/L，W6的碱度值最小，为2 200 mg/L。

图2 不同温度下厌氧发酵过程的碱度

2.1.3 对CH4产量的影响 由图3可知，随着温度上升，厌氧发酵的停滞期逐渐缩短，开始产CH4的时间提前。当温度为20 ℃时，各组开始产CH4的时间在28～33 d，其中对照组W0的停滞期最长为36 d，W8的停滞期最短为14 d，说明低温下发酵系统启动较慢，且添加磁铁粉可以促进秸秆厌氧发酵的启动。同时，W0的累计CH4产量最低，说明添加磁铁粉会增加累计CH4产量(图4)。在温度为25 ℃时，各组在第20天开始产CH4，相比20 ℃提前了10 d，同时从第37天开始出现产CH4高峰期，W0的累计甲烷CH4最低，开始稳定产CH4的时间最迟。W4的日CH4产量最大，累计CH4产量(ACH4)最高。在温度为30 ℃时，产CH4时间出现在15～16 d，各处理日甲烷CH4均缓慢上升，W4和W6的累计CH4产量较高，但W4的日CH4产量在第16天之后开始急剧上升，并在第22天达到整个发酵过程的峰值，日CH4产量最大值为290 mL，W6的日CH4产量一直稳定上升，在第39天才达到最大值。对照组W0在发酵25 d后才逐渐开始产CH4，且累计CH4产量仍然处于最低水平。在温度为 35 ℃时，各组在第4天～第5天开始产CH4，第一次产CH4高峰期出现在第12天～第13天，各组停滞期较其他温度的处理有明显缩短。其中，W2在第12天出现产CH4高峰。在整个发酵过程中，最大日CH4产量可达373 mL。组间累计CH4产量差异较为明显，W2的累计CH4产量最高为5 497 mL，表明磁铁粉对厌氧发酵产CH4量的影响较大。

图3 不同温度下不同磁铁粉添加量厌氧发酵过程中日CH4产量

图4 不同温度下不同磁铁粉添加量处理下厌氧发酵过程中累计甲烷产量

在中低温条件下，秸秆厌氧发酵随着温度的增加，反应启动得更快。这是因为厌氧发酵是由一系列酶促反应组成的，在一定温度范围内，温度的增加可以导致酶活性的增强，从而使得厌氧发酵速率更快。磁铁粉的添加可以增加发酵过程中的CH4产量，表明磁铁粉可以促进厌氧发酵产甲烷菌的生长繁殖，提升甲烷菌的活性。

2.2 不同磁铁粉添加量对厌氧发酵生物酶活性变化的影响

在厌氧发酵系统中，脱氢酶作为一种重要的功能酶，与细胞内氧化磷酸化过程密切相关[15,19]，在一定程度上其活性可以反映发酵体系中的底物被微生物降解的程度[20]。一氧化碳脱氢酶以Ni-Fe形式存在，可以加快乙酸被产甲烷菌消化生成甲烷的速率[21]；发酵底物经脱氢酶催化，使该酶的受体NAD(P)+被还原为 NAD(P)H，而Fe2+这种还原剂正可协助还原反应的发生，从而提高酶活性[22]。本试验中磁铁粉作为添加剂，测量脱氢酶活性可以进一步探讨Fe元素对厌氧发酵过程的有效性。

在秸秆发酵过程中，产甲烷的速率很大程度上取决于纤维素被分解的速率[23]。纤维素和木质素能有效地被纤维素酶降解[24]。因此，纤维素酶活性也是体现厌氧发酵效果的一个重要指标[25]。司振军[26]研究表明Fe2+的添加可以增加纤维素酶的活性。因此，本研究测量纤维素酶活性旨在探究磁铁粉的添加对厌氧发酵过程的 影响。

2.2.1 对脱氢酶活性的影响 DHA可以反映厌氧发酵体系中微生物的活性[27]。从不同温度下厌氧发酵过程中脱氢酶活性的变化(图5)可以看出，随着温度的增加，DHA逐渐上升，各温度下的DHA均呈现出升-降-升的趋势。当温度为 20 ℃，第16天时，除W2以外，各组均达到第一次峰值，其中处理组W8上升到最高值为863 UI。也许是因为磁铁粉的加入增强了微生物的活性，因而表现出DHA的上升。而随着发酵的进行，在第41天～第46天时，达到第二次高峰。其中，W4处理组的DHA变化较小，当发酵结束时，仍然维持在较高水平数值为669 UI，而W8已经降到最低点为197 UI。当温度为25 ℃时，组间两次峰值数值差异较小，其中W4在第二次峰值的数据最大为1 156 UI。在温度为30 ℃时，第二次峰值明显大于第一次，但各组间数值变化趋势差异较小，其中W2的DHA最高，为1 516 UI，而对照组W0在各时期的数值均为最低，表明磁铁粉的添加可以提升DHA，从而提高微生物活性。当温度为35 ℃时，W8的DHA达到 1 536 UI，表明温度上升可以促进微生物活性。

图5 不同温度下厌氧发酵过程脱氢酶活性

2.2.2 对纤维素酶活性的影响 由图6所示，当发酵温度为20 ℃时，在发酵初期各组CEA均逐渐降低。在发酵进行到第26天时，CEA急剧上升。第31天～第36天，CEA出现最大值，说明在 20 ℃下发酵启动时间较长，麦秆水解过程较缓慢。在发酵后期，W6达到最大值。温度在 25 ℃时，CEA大体呈现为先升高后降低，且波动较大。在第11天W8出现了峰值，此后持续降低直到发酵结束。在温度为30 ℃时，各试验组的CEA均高于20～25 ℃下的CEA，并且在发酵的第6天～第21天都呈现出较高的酶活性状态。第21天～第41天，各组的CEA急剧下降，之后开始回升并保持稳定，其中W4的CEA较其他组明显更低。CEA在温度为35 ℃下的变化趋势与在30 ℃的变化一致，但组内峰值差异较大，W6出现峰值的时间最晚且峰值最大，证明W6的底物水解较晚但水解速率较快。

图6 不同温度下厌氧发酵过程纤维素酶活性

2.3 冗余分析和相关性分析

利用冗余分析(RDA)对酶活性和温度、磁铁粉、pH、碱度、日CH4产量和累计CH4产量之间的相关性进行检验。如图7所示，CH4、碱度、温度和pH对酶活性的解释率大于20%(P= 0.002)，是影响酶活性的主要因子。其中纤维素酶的活性与磁铁粉相关，也许是因为Fe元素参与纤维素酶的合成[28]。随着纤维素酶活性增强，可以溶解更多的底物，导致厌氧发酵体系中小分子酸增多，甲烷菌可利用的前体物质增加，从而提高秸秆厌氧发酵的产气量。脱氢酶活性与碱度和累计甲烷产量明显相关，可能是因为基质脱氢这一化学反应主要依靠脱氢酶，如果脱氢酶活性不足，厌氧发酵后续的产氢反应将会严重受阻[19]，进而影响CH4产量。

ALK.碱度；ACH4.累积甲烷产量

温度和磁铁粉添加量的不同使得试验中的pH、碱度、CH4产量以及酶活性都产生变化，但是通过双因素相关性分析(表3)可得出温度与pH、碱度、日CH4产量、累计CH4产量以及纤维素酶活性之间的关系十分显著，与脱氢酶活性关系显著。这是因为温度上升使得酶活性增强，加快了反应的进行，从而使得pH等指标发生改变。磁铁粉与碱度之间的关系十分显著，表明磁铁粉的添加可以增强厌氧发酵系统的稳定性。总体来说，温度与各指标之间的相关性明显强于磁铁粉，温度是影响该试验最关键的因素，这与冗余分析的结果对应。有研究表明发酵温度为35 ℃时最适合于牛粪中温厌氧发酵微生物菌群的生长，使得发酵启动最快[29]。磁铁粉和温度二者的交互作用对pH和碱度的相关性十分显著，与累计CH4产量的相关性显著。

表3 温度(T)和磁铁粉双因素相关性分析

2.4 动力学参数变化分析

厌氧发酵产气过程的变化可以被认为是微生物生长变化的函数[30]。从拟合结果(表4)可以看出，各处理厌氧发酵产气特性基本上与模型拟合度较高(R2>0.98)，可以反映出体系中底物成分无差异，且添加磁铁粉后对体系的稳定性有促进作用。停滞期是反映厌氧消化性能的一个重要指标。模型结果(表4)表明，随着温度的升高，停滞期逐渐缩短，并且从整体趋势来看，累积甲烷产气潜力也明显增加。在35 ℃下，添加磁铁粉后厌氧发酵停滞期缩短，但磁铁粉添加过量后停滞期反而增长，说明适量磁铁粉有利于反应体系中厌氧微生物的增殖和活化，从而提高对底物的转化效率，这与T90的变化一致，但过量的磁铁粉会抑制微生物活性及基质的代谢从而造成产气量降低[31]。

表4 不同温度下厌氧发酵过程预测的模型参数

采用序列综合法对各温度下麦秆厌氧发酵过程中累积CH4产量、停滞期、发酵周期以及前期所分析的pH、碱度、CH4产量、DHA、CEA等指标进行分析，可得出麦秆在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃发酵过程中，最佳磁铁粉添加量分别为8、6、4、2 g/L。

3 结 论

在麦秆厌氧发酵过程中，添加适量磁铁粉可以使得发酵过程中pH下降和回升速率更快，加快了发酵系统的启动，同时使得碱度上升较快并且更易维持稳定，增大发酵系统的缓冲力，可以促进秸秆厌氧发酵的产甲烷量，同时可以增强厌氧发酵系统中酶活性。综上所述，麦秆在20～35 ℃进行厌氧发酵时，磁铁粉最适添加量分别为8、6、4、2 g/L，累积甲烷产量分别提高154%、103%、160%、10.2%。磁铁粉对麦秆在不同温度下的厌氧发酵过程中DHA与CEA有一定促进作用，且与CEA的相关性大于DHA。但是DHA与发酵过程中的碱度、甲烷产量之间的相关性大于CEA。但添加的磁铁粉中也含有其他极少量微量金属元素，可能对试验结果也有影响，同时试验未探究更高温度下磁铁粉对厌氧发酵特性及酶活性的影响，会在今后的研究中补充完善。