基于蛋白质组学技术的多囊卵巢综合征患者卵泡液研究

高丹丹，孙振高，马英杰，王欣磊，张祎，李丽

(1.山东中医药大学中医学院，济南 250014；2.山东中医药大学附属医院，济南 250014；3.山东中医药大学第一临床学院，济南 250014)

多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄期妇女常见的内分泌及代谢紊乱性疾病，作为无排卵性不孕的主要原因，其卵泡微环境的分子多样性尚未完全阐明[1]。PCOS约占女性无排卵性不孕的80%[2]，临床表现有高度的异质性[3]，主要表现为高雄激素血症、排卵功能障碍、多囊卵巢、不孕症、胰岛素抵抗、肥胖、脂代谢异常、慢性低度炎症等[4]，有约6%～20%的育龄期妇女生活受到影响[5]，且长期并发症风险高，目前认为调整生活方式是治疗PCOS的方法之一[6]。相关研究表明，PCOS可能涉及到的发病机制有下丘脑-垂体-卵巢轴功能异常、肾上腺内分泌功能异常、胰岛素抵抗和高胰岛素血症，同时还与环境及遗传因素有关[7]。

PCOS病理发展的分子机制尚不清楚[8]，现研究者试图利用蛋白质组学技术寻找突破。蛋白质组学是指一个细胞所表达的全部蛋白质的总和[9]，以蛋白质为研究对象，弥补了基因组学的局限性，提供了蛋白质作为细胞功能的额外信息，其主要研究细胞、组织、器官、机体等蛋白质的表达、翻译后的修饰以及蛋白质间的相互作用。在疾病研究中，蛋白质组学具有多种功能，主要包括新标志物的发现，某些疾病相关蛋白的筛选和鉴定，发病机制的研究和探索，早期临床诊断标准的发现，寻求新的治疗方法等。

卵泡液是由血浆渗出液和颗粒细胞、卵泡膜细胞的分泌物组成，为卵母细胞提供了生长发育的微环境，其主要成分为蛋白质、类固醇激素、多糖、代谢物、活性氧(ROS)以及抗氧化物等，这些成分在卵泡发育、成熟及排卵过程中起着重要作用[10]。卵泡液成分可反映卵巢细胞分泌过程的细微变化，以及病理条件下血浆成分的变化；同时利用蛋白质组学鉴定卵泡液成分弥补了通过观察卵母细胞发育阶段和形态来评价卵母细胞质量的不足。

一、蛋白质组学技术的发展

蛋白质组(proteome)概念最早于1994年提出，蛋白质组学技术的诞生为生命科学的发展提供了更广阔的前景[11]。蛋白质组是一个在时间和空间上动态变化的整体[12]，近年来蛋白质组学技术在疾病研究方面越来越受到重视，其在阐明疾病病理机制方面有重要作用，可以筛选出差异蛋白，找到疾病治疗靶点[13]。

蛋白质组学技术主要分为两种，一种是基于双向凝胶电泳(2-DE)定量技术，主要是荧光差异凝胶电泳，该技术在传统2-DE技术基础上与荧光染技术相结合，避免了传统2-DE重复性差，提高了敏感度[14]。另一种是基于液相色谱-串联质谱技术(LC-MS/MS)定量技术，该技术主要包括非标记定量技术、同位素标记定量技术两种，LC-MS/MS在大规模检测、鉴定和定量方面具有巨大的潜力[15]，其中绝对定量技术(iTRAQ)是目前研究中应用最多的，其样本可以是经胰蛋白酶酶切的多肽，该技术可以绝对定量蛋白质，具有灵敏度高、数据准确、蛋白质覆盖率高、重复性好等优势[16]。

二、蛋白质组学技术在卵泡液研究中的应用

卵泡液提供了卵母细胞生长发育的微环境，因此，PCOS患者卵泡液蛋白表达谱可以反映PCOS患者卵泡微环境的改变和卵泡发育相关的独特病理生理学信息。1996年Spitze等[17]开启了对人类卵泡液蛋白质组的研究。

1.卵泡液中差异蛋白的筛选：Ambekar等[18]采用LC-MS/MS分析PCOS患者卵泡液蛋白质组成，鉴定出186种蛋白质存在差异丰度。差异蛋白主要包括双向调节蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖2、肿瘤坏死因子(TNF)、α诱导蛋白6、纤溶酶原和淋巴管内皮透明质酸受体1等，这些蛋白参与卵泡成熟和排卵过程。卵丘-卵母细胞复合体(COC)基质的形成、扩张和粘液化是排卵、受精的关键，双向调节蛋白的差异表达使得COC基质的扩张出现缺陷；还有部分蛋白质与血管生成及纤溶系统相关。另外还从卵泡液中鉴定出了一些新的蛋白质，包括超盆地蛋白(suprabasin)、S100钙结合蛋白A7(S100-A7)、锌指2螺旋酶、转录辅助激活剂，但这些蛋白质在卵巢中的功能还尚未明确。

Li等[19]使用串联质谱(TMT)标记的定量蛋白质组学技术识别PCOS患者卵泡液外泌体中的蛋白质组特征，鉴定出86种差异蛋白，其中S100-A9蛋白通过激活核因子kappa B(NF-κB)信号途径显著增强炎症反应并影响类固醇生成。Domingues等[20]使用液相色谱-离子阱-飞行时间质谱仪(LCMS-IT-TOF)分析PCOS患者的卵泡液蛋白质组，发现胎球蛋白A和维生素D配体蛋白只在PCOS组中表达，补体C3在PCOS组中过度表达。Patil等[21]利用LC-MS/MS鉴定出PCOS患者卵泡液中10种差异表达的糖蛋白，其中蛋白酶抑制剂SERPINA1和ITIH4上调、下调尤为明显，SERPINA1能够抑制组织重塑和促血管生成的蛋白酶，ITIH4可以维持细胞外基质(ECM)的稳定。Zhang等[1]使用LC-MS/MS的定量技术对肥胖、超重的PCOS患者和正常体重的PCOS患者进行卵泡液蛋白质组分析，发现炎症、免疫、代谢相关的生物过程在PCOS的两个亚群中都有富集，且肥胖会加剧卵泡微环境的异常。

在Ambekar等[18]和Patil等[21]的研究中均提到关于卵泡血管生成蛋白质的改变，血管生成改变可能导致卵泡发育停止、卵母细胞生长受损以及PCOS患者常见的黄体形成缺陷；而且均发现与ECM相关，这些蛋白可能导致ECM不稳定，影响COC的扩增，继而导致卵母细胞质量和受精能力下降。Li等[19]和Zhang等[1]研究发现差异蛋白与炎症反应相关，这些蛋白能触发炎症相关的信号通路，在诸多细胞过程中发挥重要作用。上述观点提示在卵泡液的研究中差异蛋白多与血管生成、COC基质的扩增、ECM的稳定以及炎症反应等相关，而这些过程与卵泡发育密切相关。

2.子宫内膜、卵巢、血液中差异蛋白的筛选：有研究使用电离串联飞行时间质谱方法，发现PCOS患者子宫内膜上差异表达蛋白与细胞凋亡、氧化应激、炎症以及细胞骨架、凝血功能相关，参与细胞重塑的几种蛋白如微管调节因子(Stathmin)、蛋白二硫化物异构酶(PDI)、酶调节剂(SERPINA1)、甲状腺素运载蛋白(Transthyretin)、热休克蛋白、载脂蛋白A1和膜联蛋白A4在PCOS中的代谢功能均发生显著改变，从而影响子宫内膜的容受性，降低妊娠率[22]。差异凝胶电泳(DIGE)和质谱技术分析显示了PCOS患者卵巢中膜相关孕激素受体组分1(PGRMC1)、视黄醇结合蛋白1(RBP1)、热休克蛋白90B1、钙调蛋白1、膜联蛋白A6和原肌球蛋白2的差异表达；这些差异蛋白与胰岛素抵抗、类固醇的生成、纤溶、凝血以及细胞凋亡等有关[23]。其中PGRMC1可激活细胞色素P450，在类固醇合成中起重要作用；热休克蛋白90B1与多种细胞内受体和转录因子相互作用，在PCOS发病机制中可能具有促进细胞增殖的作用。最近Rashid等[24]利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术发现，参与转录调节、胚胎发生、DNA修复、蜕膜细胞倍性、免疫调节、细胞内转运和降解过程的蛋白质在PCOS患者的血清蛋白质谱中差异表达。

3.诊疗策略：通过对PCOS患者卵泡液、卵巢、子宫内膜和血清蛋白质组学的研究，发现在这些生物液和组织中有相似的差异蛋白和发病机制，主要涉及类固醇的生成、COC基质的扩增、ECM的稳定、血管生成、细胞凋亡、炎症及凝血等。陈莉等[25]在综述中也发现PCOS患者不同组织的蛋白质组学结果存在不同，但仍存在一定的联系。相较于之前对PCOS的研究中更多集中在炎症反应和氧化应激，蛋白质组学技术使PCOS的治疗得到更多方面和维度的思考。

PCOS是一种非特异性的慢性炎症性疾病，被认为是卵巢功能障碍的原因之一[26]。TNF是由巨噬细胞分泌的一种小分子蛋白，有炎症介质的作用，属于炎症因子的一种。之前的动物实验发现黄酮类芹菜素可以显著降低TNF-α、白介素-6和总氧化状态[27]。Wu等[28]在动物实验中发现热休克蛋白与TNF、白介素-6、C反应蛋白呈现出明显的负相关关系，热休克蛋白可以作为PCOS炎症指标检测的一项。Alivandi等[29]在动物实验中发现大豆异黄酮苷可以改善PCOS的炎症及氧化状态。有研究发现糖基化终产物可溶性受体(sRAGE)对PCOS产生的炎症反应具有一定的保护作用，认为sRAGE具有一定的抗炎效果[30]。有文献报道维生素D可以拮抗晚期糖基化产物(AGEs)，认为PCOS尤其伴有糖代谢异常的患者在治疗上可以选择应用维生素D[31]。还有研究发现AGEs是一种促炎分子，可与细胞表面受体相互作用，介导促炎通路和氧化应激的触发[32]。

卵泡中褪黑色素是在卵泡发育后期从颗粒细胞中释放出来的，在卵母细胞成熟过程中起积极作用[33]。褪黑色素的主要作用包括抗氧化和清除自由基[34]。有研究证实在临床试验中使用褪黑色素可明显改善PCOS患者未成熟卵泡的质量，显著提高IVF-ET的妊娠率[35]。2009年的一篇综述详述了褪黑色素可能成为改善卵巢功能和卵母细胞质量的药物[36]。之后有文献论述了褪黑色素可能通过改善卵泡代谢提高卵母细胞和胚胎质量[37]。

动物实验证实氯化血红素和L-精氨酸能改善多囊卵巢(PCO)大鼠的氧化状态、炎症反应、激素失衡和代谢紊乱等，提示氯化血红素和L-精氨酸对PCOS均有保护作用[38]。有学者认为酪蛋白激酶2α可能是PCOS一个有前途的临床治疗靶点[39]。最新的动物研究发现microRNA-135a可能通过血管内皮生长因子C信号途径促进PCOS中颗粒细胞的凋亡和DNA损伤反应，提示microRNA-135a是PCOS的一个治疗靶点[40]。

目前对于PCOS的治疗没有特效药，临床医生的主要目标是解决PCOS患者的生育要求，保证月经定期来潮和避免并发症的发生，比如克罗米芬、醋酸环丙孕酮炔雌醇片、二甲双胍等药物的应用。在动物实验中应用抗炎、抗氧化、改善信号途径等的药物可以对PCOS产生一定效果。近年来，利用蛋白质组学技术发现了一些新的差异蛋白，并对这些蛋白参与PCOS疾病的发生发展做出了一些假设并得到验证；但关于卵泡液的蛋白质组学研究尚处于起步阶段，一些新的治疗靶点的发现，将对未来药物的研发提供理论依据，但具体的治疗途径等还需进一步的研究探讨。

三、结语

PCOS是一种常见的生殖内分泌代谢性疾病。近年来随着蛋白质组学的发展，尤其是差异蛋白质组学技术的提高，科研人员利用该技术对PCOS的发病机制进行研究，通过对卵泡液的研究，筛选出了新的差异蛋白，这些差异蛋白揭示了PCOS发病的相关机制。PCOS患者卵泡液蛋白质组学的改变多与类固醇的生成、COC基质的扩增、ECM的稳定、血管生成、细胞凋亡、炎症反应及凝血功能等有关。对卵巢、子宫内膜及血清的蛋白质组学研究中发现PCOS还与氧化反应有密切联系。关于PCOS炎症反应的治疗有较多研究，且已经有了一些具体的治疗措施，如使用黄酮类芹菜素、热休克蛋白、大豆异黄酮苷、糖基化终产物可溶性受体以及褪黑色素等。关于PCOS治疗不能忽视的一点是生活方式的调节。现阶段利用蛋白质组学技术对卵泡液的研究尚处于起步阶段，筛选出的差异蛋白并不能完全掌握其在疾病中的具体发病机制，需要更加深入的研究，找到疾病有效且安全的治疗靶点，以期促进新药物研发，给PCOS患者提供有效、便捷、经济的治疗手段。