PLGA微球搭载鹿茸多肽对去卵巢骨质疏松大鼠保护作用研究

龚庆 宋秋莹 邱莉晶 黄晓巍* 赵文海*

1.长春中医药大学附属医院骨科，吉林 长春 130021 2.长春中医药大学药学院，吉林 长春 130117

骨质疏松症是一种临床常见老年性疾病，绝经后女性也是易患人群。中医传统理论认为，骨质疏松属于“骨痹、骨痿”等病的范畴，其病变在骨，本在肾[1]。人体骨骼的生长、发育或退化与肾之精气密不可分，肾虚是骨质疏松症的一个重要诱因，即中医“肾主骨生髓”理论，肾能生髓，髓能充骨，肾气旺则骨骼韧[2-3]。鹿茸具有补肾壮阳、强筋健骨的功效，是中医临床骨病治疗的核心药材[4]。鹿茸多肽(velvet antler polypeptides, VAP)是鹿茸的主要药效物质，通过传统的复合乳液溶剂蒸发法制备载药PLGA微球可有效提高其生物利用度。本文采用卵巢切除术复制大鼠骨质疏松模型，探讨PLGA微球搭载VAP对骨质疏松的保护作用及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：健康Wistar大鼠48只，3月龄，雌性，SPF级，体质量(180±10)g，购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，动物许可证号码：SCXK(吉)-2016-0003。实验动物标准条件下自由饮水和摄食。

1.1.2实验试剂：搭载VAP的PLGA微球(长春中医药大学制备)；阿仑膦酸钠片，规格：6片/盒、10 mg/粒，石药集团欧意药业有限公司(国药准字H20061303)；钙(Ca2+)测试盒、碱性磷酸酶(ALP)测试盒、酸性磷酸酶(ACP)测试盒、骨钙素(OC)放射免疫分析药盒，碧云天生物技术有限公司(批号：20181130、20182662、20181589、20183389)；Runx2(runt-related transcription factor 2)和骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2, BMP-2)一抗、二抗、ECL化学发光显色剂，武汉三鹰生物科技有限公司(货号：Ag28113、18933-1-AP、SA00001-2、B500024)。

1.1.3实验设备：PUS-2018G半自动生化分析仪(普朗医疗科技公司)；BI-2000图象分析系统(成都泰盟科技有限公司)；骨密度测定仪(美国 HOLOGIC discovery WA)；Multiskan FC型酶标仪(美国Thermo公司)；CKX41型光学显微镜(日本OLYMPUS公司)；TB-718D型生物组织自动包埋机、TS-12U生物组织自动脱水机、TK212型自动恒温漂片仪、TK213型自动恒温烘片仪(湖北省孝感市宏业医用仪器有限公司)；OmegaLum C型凝胶成像仪(美国Aplegen公司)。

1.2 实验方法

1.2.1模型制备：48只大鼠随机分为假手术组(SHG)、模型对照组(MCG)、阿仑膦酸钠组(ALG)、PLGA包载VAP的低、中、高剂量组(VLG、VMG、VHG)，每组8只。2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，除SHG组外，其他各组均摘除双侧卵巢，术后腹腔注射青霉素钠10万单位/只，连续3 d。SHG组在相同位置做切口而不摘除卵巢，切除卵巢附近等量的脂肪组织。

1.2.2药物干预：各组大鼠均采用灌胃给药的方式，给药剂量如下：ALG组给予阿仑膦酸钠24 mg/kg，VLG、VMG、VHG分别给予PLGA包载的VAP 22.5 mg/kg、45 mg/kg、90 mg/kg，SHG组、MCG组给予等容量的蒸馏水，每天1次，连续给药3个月。末次给药后24 h，2%戊巴比妥钠麻醉后腹主动脉取血，3 500 r/min离心10 min,取血清，超低温冰箱保存备用。行动物脱颈椎处死后，分别取其左、右两侧股骨。

1.2.3血清生化指标检测：按试剂盒说明书上的方法分别检测各组大鼠血清中Ca2+、ACP、ALP和OC的含量。

1.2.4股骨骨密度测定：取各组大鼠左侧股骨，按照骨密度测定仪说明书上的操作步骤进行检测。

1.2.5骨结构光镜观察：取右侧股骨粗隆部位用10%甲醛固定，制作常规石蜡切片，HE染色，BI-2000图象分析系统测量骨皮质平均厚度(bone cortical thickness, BCT)和骨小梁面积(trabecular bone area, FTA)。

1.2.6Western blot检测股骨Runx2和BMP-2蛋白表达水平：将收集的股骨经PBS清洗后，提取总蛋白。通过BCA蛋白定量试剂盒对样品进行蛋白定量，调节蛋白浓度为2 g/L；将蛋白样品与等体积2×样品缓冲液混合后，100 ℃水浴5 min后即刻放入冰浴中冷却；将样品加到SDS-PAGE胶的加样孔内，每孔加样20 μL，280 mA恒定电流转膜60 min。转膜结束后，取出PVDF膜，TBST洗3次，每次5 min，之后将膜放入5%的脱脂奶粉中，水平摇床，室温下封闭2 h。封闭结束后，将膜取出，TBST浸洗3次，每次5 min，加入相应的一抗(1∶1 000)稀释液，4 ℃储存，过夜。加HRP标记二抗(1∶2 000)，水平摇床，室温封闭2 h。加ECL发光液，室温孵育1 min。将膜正面朝上放到凝胶成像仪内，拍照、记录结果。以目的条带与内参照的吸光度(A)比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 血清生化指标结果

给药3个月后，与SHG组比较，MCG组、ALG组、VLG组、VMG组和VHG组大鼠血清中ACP、ALP和OC水平明显升高，Ca2+水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。与MCG组相比，ALG组、VLG组、VMG组和VHG组大鼠血清中ACP、ALP、和OC水平明显降低，Ca2+水平明显升高(P<0.05或P<0.01)，见图1。生化分析仪检测结果表明，PLGA搭载的VAP对去卵巢骨质疏松大鼠血清生化指标有明显的调节作用，并呈一定的剂量依赖性。

图1 各组大鼠血清ACP、ALP、OC和Ca2+的含量注：与SHG组相比，##P<0.01；与MCG组相比，*P<0.05，**P<0.01。Fig.1 Concentration of serum ACP, ALP, OC and Ca2+ of rats in each

2.2 股骨BMD测量结果

骨密度仪检测结果表明，与SHG比较，MCG和VLG组大鼠股骨BMD明显降低(P<0.05或P<0.01)。与MCG组比较，ALG、VMG和VHG组大鼠股骨BMD明显升高(P<0.05)。见图2。

图2 各组大鼠骨密度检测结果注：与SHG组相比，#P<0.05，##P<0.01；与MCG组相比，*P<0.05。Fig.2 Restults on BMD of rats in each

2.3 股骨HE染色结果

通过对股骨粗隆部位HE染色观察结果表明，鹿茸多肽和阿仑膦酸钠对去卵巢骨质疏松大鼠BCT和FTA有明显的改善作用。具体情况如下：与SHG组比较，MCG组大鼠BCT明显降低，MCG组、ALG组、VLG组、VMG组和VHG组大鼠FTA明显降低(P<0.05或P<0.01)。与MCG组比较，ALG组、VLG组、VMG组和VHG组大鼠BCT和FTA明显升高(P<0.01)。见图3。

图3 各组大鼠HE染色结果注：与SHG组相比，##P<0.01；与MCG组相比，*P<0.05，**P<0.01。Fig.3 Restults on HE staining of rats in each

2.4 股骨Runx2和BMP-2蛋白表达水平

Western blot结果表明，与SHG组比较，MCG组、ALG组、VLG组和VMG组大鼠股骨Runx2蛋白表达水平明显降低，MCG组、VLG组、VMG组和VHG组大鼠股骨BMP-2蛋白表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。与MCG组比较，ALG组、VLG组、VMG组和VHG组大鼠股骨Runx2和BMP-2蛋白表达水平均明显升高(P<0.05或P<0.01)。见图4，表1。

图4 各组大鼠股骨Runx2和BMP-2蛋白表达电泳图Fig.4 Runx2 and BMP-2 protein expression electrophoresis diagram of rat femurs in each group

表1 各组大鼠股骨Runx2和BMP-2蛋白表达结果

3 讨论

骨质疏松症是一类代谢障碍性骨病，常见于老年人及绝经期妇女，临床常见的病理特征包括骨皮质厚度降低、骨小梁面积减少、Ca2+流失等等，同时伴随着骨密度降低进而诱发骨折的发生，危及患者的生活质量[5]。

鹿茸在中医骨病的治疗方面历史悠久，具有补肾壮阳、生精益血、补髓健骨等诸多功效[6-8]。VAP为鹿茸的主要药效物质，现代研究[9-11]表明，其能促进组织愈合并对多种细胞的增殖、分化有较好的促进作用，同时可提高机体自身免疫力，加速损伤部位的修复。Yang CH等[12]在体外实验中验证了VAP可以通过激活EGF/EGFR信号通路保护成骨细胞(MC3T3-E1)免受炎症和氧化损伤的影响；李文超等[13]通过原带培养SD大鼠椎间盘软骨终板细胞验证了一定浓度的VAP可以改善基质代谢，延缓椎间盘软骨终板的退变。但鹿茸多肽在应用时不得不面对半衰期短、受体内复杂环境影响易被蛋白酶降解等诸多因素影响的问题，通过改良药物剂型，提高药物生物利用度是切实可行的办法。本研究以PLGA为载体搭载VAP达到药物缓释靶向的目的，有效解决了上述问题且安全无毒副作用[14-15]。本研究在此基础上构建去卵巢骨质疏松大鼠模型，以ALG为阳性对照，评价PLGA微球搭载VAP对于骨质疏松症的治疗作用，并探讨可能的作用机制。

骨密度是评价骨质疏松损伤程度的最直观指标，血清生化指标Ca2+、ALP、ACP和OC可有效反映机体的骨代谢水平，BMD降低、血清生化指标紊乱将极大增加患者骨折的危险[16]。本实验研究结果表明，PLGA微球搭载VAP可改善机体钙离子吸收的环境，提高去卵巢大鼠骨密度，并通过降低血清中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶和骨钙素的含量，抑制破骨细胞活性从而有效延缓骨质疏松的发生。此外，通过HE染色观察股骨微观形态学，检测结果表明PLGA微球搭载VAP可以显著增加BCT和FTA进而改善模型大鼠的骨质。

Runx2和BMP-2在骨发育的不同阶段扮演重要角色，可调控成骨细胞的分化、软骨细胞成熟、细胞外基质的分泌、诱导间充质细胞的增殖分化等诸多过程，是骨形成、骨代谢过程中关键的调节因子[17-18]。Western blot研究结果表明，PLGA微球搭载VAP可显著提高去卵巢骨质疏松大鼠股骨Runx2和BMP-2蛋白表达水平。

综上所述，PLGA微球搭载VAP对去卵巢大鼠骨质疏松症有明显的保护作用，其作用机制可能与提高股骨Runx2和BMP-2蛋白表达水平有关。