辛伐他汀联合雌二醇对去卵巢大鼠骨质疏松的影响

李泽清 丁军稳 任荣 丁启龙 王哲 米涛 陆川 李钊伟 *

1. 青海大学附属医院，青海 西宁 810000 2. 青海省湟中县第二人民医院，青海 西宁 811601

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是以骨量(骨矿物质和骨基质)减少、骨组织显微结构退化(骨小梁结构破坏、变细和断裂)，骨生物力学改变(骨力学强度下降、骨载荷承受力降低、骨脆性增高)和骨折危险性增加为特征的全身代谢性骨病[1]。随着全社会人口的老龄化，OP的发病率逐年上升，OP已成为老年人的一种常见病、多发病，其常常合并严重并发症(如骨折)，且预后较差，给家庭和社会带来了沉重的经济负担[2]。目前防治OP的药物主要分为4类：①促进骨矿化药物；②促进骨形成药物；③抑制骨吸收药物；④解偶联剂。雌激素水平降低是OP的重要诱因之一，雌激素替代疗法(hormone replacement therapy，HRT)是目前防治OP的有效措施[3]。近年来研究表明辛伐他汀具有激活成骨细胞、促进骨合成代谢和骨形成作用，这一特性为进一步寻找防治OP药物指明了新方向和新思路[4]。本研究试图观察辛伐他汀、雌二醇联合干预对大鼠骨质疏松的影响，旨在为OP的临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

清洁级雌性SD大鼠75只，3月龄，体重320～350 g，由青海大学医学院动物实验中心提供，辛伐他汀(舒降之)：40 mg/片，生产批号：1810261，美国默沙东公司；苯甲酸雌二醇：100 μg/支，生产批号：1708072，浙江仙居制药厂。EXPERT型双能X线骨密度测定仪购于美国LUNAR公司，MTS-858型骨生物力学实验机购于美国MA公司，碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)、I型前胶原羧基端前肽(PICP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)检测试剂盒购于美国R&D公司。

1.2 方法

1.2.1实验分组及处理：75只雌性SD大鼠按随机数字法分组；假手术组、去势组、辛伐他汀组、雌二醇组、联合药物组。假手术组仅切除部分脂肪组织，其他4组均行双侧卵巢切除术。造模成功后于第2天给予同药物处理，辛伐他汀用0.9%Nacl配制1 mg/mL混悬液，假手术组、去势组：皮下注射等量0.9% Nacl，1次/d；辛伐他汀组：辛伐他汀[4 mg/(kg·d)，灌胃，1次/d]；雌二醇组：苯甲酸雌二醇(1 mg，肌肉注射，1次/d)；联合用药组：辛伐他汀[4 mg/(kg·d)，灌胃，1次/d]+苯甲酸雌二醇(1 mg，肌肉注射，1次/d)，连续用药6周。

1.2.2去卵巢骨质疏松大鼠模型：2%戊巴比妥钠腹腔麻醉，备皮消毒，取腹背部中线第2腰椎水平做长约2 cm双背侧纵行切口，依次分离进入腹腔，寻找卵巢组织，平镊将卵巢牵出，严密结扎输卵管及其周围血管、脂肪组织，完整切除双侧卵巢，假手术组仅切除卵巢周围等量脂肪组织，不予切除卵巢和结扎输卵管，冲洗伤口，止血彻底，逐层缝合，关闭腹腔，术后立即注射青霉素20万U预防感染。

1.2.3标本取材与处理：药物干预6周，2%戊巴比妥钠腹腔麻醉，采用快速心脏急性大失血法处死大鼠，取血8～10 mL，高速冷冻离心，3 000 r/min×10 min，EP管收集上层血清1～2 mL，-20 ℃保存备用。逐层剥离L4腰椎和双侧股骨，剔除周围软组织，以无菌生理盐水湿纱布包裹，置于-20 ℃保存备用。另留取椎体10%甲醛溶液固定，10% EDTA 6周，乙醇脱水，二甲苯透明，制备石蜡切片，60 ℃烤箱4 h，保存备用。

1.2.4骨代谢相关生化指标检测：取出上清液，采用ELISA试剂盒检测血清中ALP、BGP、PICP、TRAP，按试剂盒说明书步骤操作。

1.2.5骨组织骨密度(bone mineral density，BMD)和矿物含量(bone mineral content，BMC)测定：取出待测大鼠L4腰椎和右股骨，在LUNAR双能X线吸收扫描仪扫测，采用小物体Discovery Wi扫描模式：扫描类型hHi-Res、扫描精度1%、扫描速度60 mm/s、扫描宽度5.0 cm、分辨率1.0 mm×1.0 mm等参数值，用仪器选定兴趣区，以2.0 mm×2.0 mm为中心区域，应用小动物软件分析计算BMD和BMC值。

1.2.6骨生物力学指标检测：取出腰5椎体和右侧股骨，游标卡尺测量椎体和股骨长度，将置于电子万能生物力学材料试验机进行三点弯曲力学试验，固定骨标本位置，保持标本上下面水平，支点跨距20 mm，最大量程1 000 N，加载速度1 mm/min，计算机记录仪记录载荷-变形曲线，计算最大载荷、最大应力、最大位移和结构刚度。

1.2.7HE染色：取出石蜡切片，脱蜡，水化，流水冲洗，苏木精染色10 min，流水冲洗，0.5%盐酸酒精分化10 s，流水冲洗30 min，返蓝，蒸馏水洗涤3～5 s；伊红染色2～3 min，流水冲洗；再次脱水，透明；封片，光镜下观察染色并采集图片。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 骨代谢相关生化指标

去势组血清ALP、BGP、PICP、TRAP水平较假手术组显著增高(P<0.05)，辛伐他汀组、雌二醇组、联合药物组血清ALP、BGP、PICP、TRAP水平较去势组均降低，其中尤以联合用药组降低最显著(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清骨代谢指标比较Table 1 Comparison of serum bone metabolism markers among the groups

2.2 骨组织BMD和BMC

去势组腰椎和股骨BMD和BMC较假手术组显著降低(P<0.05)，辛伐他汀组、雌二醇组、联合药物组较去势组腰椎(L4)和股骨BMD和BMC均增高，其中以联合药物组增高最显著(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠腰椎和股骨BMD和BMC比较Table 2 Comparison of BMD and BMC in lumbar spine and femur among the groups

2.3 骨生物力学指标

去势组股骨最大载荷、最大应力、最大位移和刚度较假手术组均显著降低(P<0.05)，辛伐他汀组、雌二醇组、联合药物组较去势组股骨最大载荷、最大应力、最大位移和刚度均显著增高，其中以联合用药组增高最显著(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠股骨生物力学指标比较Table 3 Comparison of biomechanical indexes of femur among the groups

2.4 骨组织形态学

假手术组腰椎骨组织结构完整，骨小梁密集，粗细适中，排列整齐，连接成网状，脂肪细胞少。去势组骨组织呈骨质疏松特征性表现，骨小梁明显减少，稀疏，游离端多，排列紊乱，网状结构破坏，大量纤维组织，髓腔内大量空泡状脂肪细胞。辛伐他汀组和雌二醇组骨小梁数量增多，排列尚规则，网状结构略微修复，结构仍不完整，脂肪细胞变少。联合药物组骨组织结构较完整，骨小梁数目明显增多，致密均匀粗壮，连接成网状结构，脂肪细胞明显减少。见图1。

图1 各组大鼠HE染色观察骨组织的形态结构变化(×200) A：假手术组；B：去势组；C：辛伐他汀组；D：雌二醇组；E：联合药物组。Fig.1 Morphological changes of bone tissue observed with HE staining (×200) A：Sham operation group；B：Castration group；C：Simvastatin group；D：Estradiol group；E：Combination drug group.

3 讨论

随着我国人口老龄化进程的加剧，21世纪中叶将步入老年高峰期，OP严重危害中老年人群的健康和生活质量，对公共卫生造成严重危害。目前治疗临床防治OP药物种类繁多，作用特点不同，但单药在疗效、副作用和安全性等方面存在很多问题，治疗效果皆不够理想[5]。因此，进一步寻找抗骨质疏松的联合药物干预对防治OP有重大意义。

雌激素水平下降是老年骨质疏松的主要诱因。雌激素匮乏可打破成骨与破骨效应平衡环境，成骨和破骨比例失衡，骨形成减少，骨吸收增强，骨量丢失，引发骨质疏松[6]。雌激素是目前临床应用防治OP的主要药物，HRT治疗OP的目的是用雌激素进行生理性补充，发挥其最大临床效应[7]。雌激素的抗骨质疏松作用主要是通过直接结合破骨细胞表面受体，抑制破骨细胞生长、分化，延缓骨量减少进程，抑制骨吸收；又可直接结合成骨细胞表面受体，调节成骨代谢，诱导促进骨形成骨重建等[8]。

辛伐他汀是目前临床常用于降低胆固醇、预防心血管疾病的药物，属于3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂。其通过增加骨密度，恢复骨微结构，抑制骨吸收，促进骨形成等，起到抗骨质疏松作用[9]。辛伐他汀既能促进骨形成，又抑制骨吸收，它通过多种路径发挥抗骨质疏松的作用：①抑制HMG-CoA还原酶活性，诱导骨形成蛋白-2(BMP-2)基因表达，诱导成骨细胞分化，骨基质形成及基质的矿化过程，促进新骨形成[10]；②抑制骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成脂分化，诱导其转化为成骨细胞，促进骨形成；③激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径，促进成骨细胞增殖和碱性磷酸酶(ALP)合成，诱导成骨细胞分化，促进骨形成[11]；④激活Ras/MAPK途径，抑制白细胞介素-6(IL-6)表达，从而抑制骨吸收；⑤通过抑制HMG-CoA还原酶，减少甲羟戊酸(MVA)的合成，减少破骨细胞数量，抑制破骨细胞作用，抗骨吸收[12]。

本研究证实辛伐他汀联合雌二醇干预对大鼠骨质疏松起到很好的防治作用，辛伐他汀联合雌二醇可通过调节去势骨质疏松性大鼠骨代谢，增加骨密度和骨矿物质，改善骨生物力学和骨组织微结构，起到抗骨质疏松疗效及骨保护作用。他汀类和雌激素类药物可能通过复杂的信号通路诱导BMP-2表达，促进成骨细胞增殖分化，促进新骨形成，从而发挥抗OP作用[13]。马庆芬等[14]研究说明雌激素和辛伐他汀序贯疗法可以增加骨密度、提高骨钙素、降低IL-6，通过抑制骨吸收，促进骨形成有效地治疗骨质疏松。王春先等[15]研究表明辛伐他汀和雌激素联合应用可增加成骨细胞碱性磷酸酶活性，提高细胞的矿化能力，对成骨细胞的分化和成熟有协同作用。张丽彦等[16]研究表明雌激素与辛伐他汀序贯疗法可有效促进骨质疏松大鼠骨形成，促进骨愈合。

综上所述，他汀类和雌激素类药物联合干预抗大鼠骨质疏松作用较单药作用更佳，这可能与两药的协同作用机制有关。但目前仍有许多问题急需解决，如提高他汀类的生物利用度、寻找最优给药剂量、给药方式以及降低长期使用雌激素不良反应。本研究的结果给后续研究留下了广阔的空间，可能还有许多不为人知的作用机制，尚有待于进一步深入研究。相信随着上述问题的解决，辛伐他汀和雌激素的应用空间将更加广阔。