变温控制策略促进地衣芽胞杆菌合成杆菌肽

宋 昭，戴 航，黄雪松，陈 雄，陈守文，李俊辉，王 志

(1 湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室，湖北省工业发酵协同创新中心，湖北省工业微生物重点实验室，湖北 武汉 430068；2 湖北大学省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室，湖北 武汉 430062;3 绿康生化股份有限公司，福建 浦城 353400)

地衣芽胞杆菌是一种常见的G+兼性厌氧菌[1]，可代谢合成部分多肽类抗生素[2]。杆菌肽是一种带有噻唑环的多肽复合物，一般利用非核糖体合成酶系以Orn、Cys、Ile等12个氨基酸为反应前体进行合成[3-5]。其在国内主要通过发酵方式获得[6]，通常在次级代谢过程中大量合成，而菌体一般在指数生长期结束或平稳期才进入次级代谢过程[7]。杆菌肽发酵期间伴有碳分解代谢物阻遏现象(CCR)，即作为速效碳源被消耗的葡萄糖，会阻止其他碳源的吸收[8-10]，利用一定量葡萄糖后菌体生长速率减慢，继而由生长转向次级代谢阶段合成产物[11-12]。但大量的葡萄糖会诱发菌株发酵期间产生CCR效应，以及产生乙酸等初级代谢副产物[13]，进而抑制次级代谢产物-杆菌肽的合成[14-16]。另外，枯草芽胞杆菌中阻遏gapB和pckA的调控因子CcpN[17]的敲除，使糖异生途径在对数期运转[18]，细胞的生长速率降低了一半[19]。同时，敲除地衣芽胞杆菌ccpN能供应更多NADPH[17,20]，效价合成效率提高16.06%[21]。因此，效价合成效率与细胞生长速率之间有着紧密的联系。而细胞的生长效率涉及营养和环境条件的综合作用，其中，发酵温度是关键因素之一。

基于以上分析，本文研究了变温控制策略对地衣芽胞杆菌生长、代谢和杆菌肽合成效率的影响，建立了有效的变温发酵策略以提高效价。

1 材料与方法

1.1 菌株

地衣芽胞杆菌DW2(BacilluslicheniformisDW2，DW2菌株)，湖北大学绿康生物工程研究所提供。

1.2 培养基

茄子瓶斜面培养基：酵母浸膏20 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂20 g/L，调pH 7.5，每个茄子瓶装入60 mL。

种子培养基：豆粕30 g/L，玉米淀粉20 g/L，轻质碳酸钙2 g/L，(NH4)2SO41 g/L，每个250 mL摇瓶装入50 mL。

发酵培养基：豆粕50 g/L，玉米淀粉30 g/L，蛋白胨5 g/L，轻质碳酸钙3 g/L，硫酸铵0.75 g/L。

1.3 培养方法

1.3.1 种子活化用无菌接种环刮取-80℃甘油管中的菌液，均匀涂抹至茄子瓶后，37℃培养24 h。

1.3.2 种子培养准备好无菌竹签和50 mL水，用竹签和水刮洗长满菌苔的茄子瓶后将菌悬液转入灭菌的250 mL摇瓶，接种量8%，即将4 mL菌悬液接于种子瓶中(接种后50 mL)。37℃、250 r/min培养24 h，得到种子液。

1.3.3 20L发酵罐培养20 L罐上接种量为5%(接种后10 L)，在通风量1.0 m3/h、温度37℃、罐压0.03 MPa、转速500 r/min条件下发酵培养。

1.3.4 20L罐发酵策略控制发酵1：发酵温度为37℃，以发酵培养基进行培养;发酵2：发酵温度35.5℃，其他保持不变;发酵3：发酵温度34℃，其他保持不变；发酵4：发酵温度32.5℃，其他保持不变；发酵5：发酵温度31℃，其他保持不变；发酵6：阶段变温实验A，0-18 h设定在37℃，18-30 h设定在34℃；发酵7：阶段变温实验B，0-18 h设定在34℃，18-30 h设定在37℃。

1.4 分析方法

1.4.1 葡萄糖的测定DNS法测定葡萄糖的含量[22]。

1.4.2 杆菌肽效价测定使用Ultimate 3000高效液相色谱测量杆菌肽效价[16]，杆菌肽标品68.5 U/mg。

1.4.3 生物量的测定取发酵液进行平板稀释涂布，得到CFU/mL结果。

1.4.4 数据处理数据结果为最少3组平行试验的均值，通过origin 9.0对数据作图分析。

2 结果与分析

2.1 37℃对DW2菌体生长和效价合成的影响

在37℃发酵培养条件下，21 h之前处于指数生长期，生物量增长迅猛，并在21 h到达最高点(110×108CFU/mL)后自溶，18 h取样pH为7.61，之后一直处于上升的趋势，至30 h发酵结束放罐pH为8.84。18 h杆菌肽效价为790 U/mL，21 h到达效价最高点(952 U/mL)，平均效价合成速率为45.33 U/(mL·h)。效价维持稳定6 h后开始降解。18 h残留还原糖8 g/L，18～21 h还原糖基本耗完，后期还原糖平稳保持在3 g/L左右，平均糖耗速率为1.9 g/(L·h)。

(a)菌体生长

2.2 35.5℃对DW2菌体生长和效价合成的影响

敲除糖异生途径调控因子CcpN对菌体生长和杆菌肽合成的影响[19]，由此可以看出杆菌肽的合成效率与细胞生长速率有紧密的联系。而细胞的生长效率涉及营养和环境条件的综合作用，其中，发酵温度是关键因素之一。因此，为了降低生长速率和糖耗速率，考虑调低温度进行发酵培养，形成发酵策略2。35.5℃培养条件下的发酵过程相关参数变化如图2所示。

(a)菌体生长

35.5℃发酵条件下生物量在21 h到达最高点(102×108CFU/mL)，只有发酵1生物量最高点的93%，21 h后菌体发生了自溶。18 h取样pH为7.48，一直上升至30 h发酵结束放罐pH为8.47，各取样点的pH值都低于发酵1。18 h残留还原糖11.37 g/L，比发酵1多出42%，即降温降低了糖耗速率，18～28 h期间，还原糖基本耗完，平均糖耗速率为1.43 g/(L·h)。另外，18～21 h是效价合成效率最高的阶段，18 h效价为557 U/mL，低于发酵1的起步效价，到达效价最高点时间比发酵1推迟了8 h，29 h效价最高点为1014 U/mL，比发酵1提高了5.4%，最终发酵2的平均效价合成速率只有34.97 U/(mL·h)。说明通过降温会降低效价合成效率，但是延长了效价的合成时间，因此最终效价提高了5.4%。

2.3 34℃对DW2菌体生长和效价合成的影响

降温至35.5℃发酵提高了效价，因而考察了进一步降低发酵温度至34℃对有关发酵参数的影响(图3)。

(a)菌体生长

在34℃发酵条件下，菌体生长周期和之前保持一致，pH也一直处于上升趋势，18h的pH为7.63，发酵结束时pH为8.11，pH增长趋势比发酵1和2缓慢，21 h到达生物量最高点(98×108CFU/mL)，比发酵2生物量降低3.9%，21 h后菌体仍然自溶。18h还原糖浓度15.58g/L，比发酵2还原糖多出37%，平均糖耗速率为1.4g/(L·h)。说明：降温34℃培养进一步减少了糖耗和生长速率。同时，18h的效价为503U/mL，比发酵2降低了9.7%，但18～27 h维持效价平稳增长，27～29 h的效价合成效率甚至更高，到29 h效价最高点1092 U/mL。由于此时pH处于碱性且菌体持续自溶，不利于继续合成效价，另外，还原糖数据显示在28-29 h碳源已然供应不足，说明之后杆菌肽合成缺乏能量供应，故未检测30 h样品，虽未出现效价拐点，但结合碳源消耗和菌体自溶情况可知，34℃培养29 h已接近效价最最高点，平均效价合成速率为37.66 U/(mL·h)，发酵期间效价合成速率稳定持久。降温培养降低了对数期的糖耗和生长速率，有利于后期杆菌肽的合成，最终对比发酵2提高了7.7%。

2.4 32.5℃对DW2菌体生长和效价合成的影响

34℃培养条件下，效价最高点相比35.5℃又有了进一步的提高，因此，继续考察了32.5℃发酵条件对发酵期间相关参数的影响(图4)。

(a)菌体生长

在32.5℃发酵温度下，pH变化趋势与发酵3一致，21 h起步pH比发酵3较高，31 h放罐pH为8.15，pH增长速率比发酵3低。发酵21 h生物量到达最高点(92×108CFU/mL)，比发酵3生物量降低6.1%，21 h之后菌体自溶；21 h还残留还原糖12.2 g/L，比发酵3的21h残糖多出16.6%；21～31 h期间，还原糖基本耗完，平均糖耗速率为1.29 g/(L·h)。杆菌肽效价在21～28 h还是保持增长，在28 h到达最高点995 U/mL，效价虽然比发酵1只提高3.4%，与发酵2、3的结果相比却降低了1.9%和8.9%，平均效价合成速率为35.54 U/(mL·h)，说明进一步降温虽然降低了糖耗和生长速率、延长了杆菌肽合成时长，但同样影响了杆菌肽合成效率。

2.5 31℃对DW2菌体生长和效价合成的影响

为了确证继续降温批发酵会进一步降低杆菌肽效价合成效率，考察31℃批发酵条件下有关发酵参数的影响(图4)。

(a)菌体生长

在31℃发酵条件下，菌体肽生长周期明显延长，pH增长趋势和发酵4一致，差异不大。菌体21～24 h处在对数生长期，生物量在24 h到达最高点82×108CFU/mL，比发酵4生物量降低了10.87%，之后依然存在自溶现象。效价在生长期至自溶期保持了稳定的增长速率，21 h起步效价381 U/mL，29 h到达最高点735 U/mL，比发酵4降低了26.1%。21 h还残留还原糖17.4 g/L，比发酵4的残糖多出42.4%，直到发酵结束31 h还有还原糖6.5 g/L，平均糖耗速率为1.2 g/(L·h)，平均效价合成速率仅为25.34 U/(mL·h)。因此，34℃培养是杆菌肽的合成最适条件。

2.6 阶段变温A对DW2菌体生长和效价合成的影响

对比发酵策略1的结果发现，在34℃发酵条件下，单位菌体杆菌肽合成速率最高，效价比对照(发酵1)提高了13.5%；随着发酵温度的降低，糖耗速率也逐渐降低，生物量也逐渐减少。考虑到前期主要是菌体生长繁殖，杆菌肽主要是中后期次级代谢合成，尝试0-18h温度控制在37℃，18 h至发酵结束控制在34℃，以此降低生长速率，减少糖耗，使更多的碳、氮源用于合成杆菌肽，形成了发酵策略6。发酵过程中有关发酵参数的变化如图6所示。

阶段变温实验A中，18 h起步pH为7.82，发酵期间依旧上升，31 h放罐pH为8.80。效价在24 h到达最高点903 U/mL，比发酵1降低了6%，比发酵3降低了17.3%。生物量在21 h到达最高点106×108CFU/mL，比发酵1生物量最高点少3.6%，比发酵3生物量最高点多8.2%，21-31 h后菌体一直自溶。18 h残糖为10.78 g，比发酵3残糖少30.8%，但比发酵1残糖多34.75%，这是由于灭罐过程产生碳源损耗不同，或装液量差异使搅拌传质效果不一样产生的糖耗差异，发酵6在0-18 h、18-21 h的糖耗速率为1.85、0.55 g/L，而发酵1在0-18 h、18-21 h的糖耗速率为2、1.55 g/L，即18 h降温能有效降低糖耗速率，延缓碳源利用。18-27 h期间，还原糖基本耗完；27 h后还原糖一直在3 g/L左右低位维持，平均糖耗速率为1.5 g/(L·h)，平均效价合成速率为37.61 U/(mL·h)。发酵1结果说明37℃培养时耗糖最快，同时效价合成效率最高，降温虽能降低糖耗，但对比发酵1发现4次降温都会使效价合成速率降低，而发酵6在18 h的残糖稍多于发酵1，且后续降温成功延缓碳源消耗，从而延长效价合成时间，但效价合成速率的降低带来影响更大，因此效价最高点只有发酵1的94%；与发酵3相比，则是发酵前期糖耗较多，留给中后期次级代谢过程中可利用的碳源较少，杆菌肽合成所需能量不够，故发酵6效价最高点只有发酵3的83%。

(a)菌体生长

2.7 阶段变温B对DW2菌体生长和效价合成的影响

由发酵策略3得到启发，尝试在细胞生长阶段降低温度减少糖耗，以使更多的碳源用于次级代谢过程。采用了0-18 h控制在34℃培养，18 h至发酵过程结束控制在37℃，形成了发酵策略7，发酵过程中有关发酵参数的变化如图7所示。

阶段变温实验B中，18 h起步pH为7.25，上升至29 h(放罐)的pH为8.35，同期pH都低于发酵6。生物量在21 h到达最高点103×108CFU/mL，比发酵1生物量最高点少6.4%，比发酵3生物量最高点多5.1%。18 h还原糖16.7 g/L，是发酵1残糖量的2倍多，比发酵3残糖多7.2%；18-27 h期间，还原糖基本耗完，平均糖耗速率为1.39 g/(L·h)。18 h前后分别34℃和37℃培养的发酵策略，使菌体前期不至于生长迅速，耗糖过快，18 h菌体生物量为63×108CFU/mL，和发酵3的18 h生物量(65×108CFU/mL)相差不大，但比发酵1的18 h生物量减少12.5%。后续升温至37℃后，效价在29 h到达最高点1193 U/mL，比发酵1提高了24%，比发酵3提高了9.2%。平均效价合成速率为41.14 U/(mL·h)。

(a)菌体生长

发酵1～7相关参数见表1。

表1 所有试验批次相关参数情况

表1中：效价是发酵期间效价最高点数据，生物量是发酵期间生物量最高点数据；生长速率是最高生物量与时间的比值，葡萄糖消耗速率是葡萄糖消耗量与时间的比值，平均效价合成速率是效价到达最高点与时间的比值。发酵7的效价最高，比发酵1和3分别提高了24%和9.2%，而平均效价合成速率仅低于发酵1。发酵3效价仅低于发酵7，说明适当降温可以减缓生长速率，延长杆菌肽合成时间，提高杆菌肽产量。发酵6和7对效价合成的影响表明变温控制策略可有效提高效价。

3 结论

DW2菌株发酵产杆菌肽过程中，菌体前期生长和初级代谢强度会影响中后期次级代谢产物-杆菌肽的合成效率。本文研究了降温和变温控制对菌体生长速率、糖耗速率和效价合成的影响，其结论如下：

1)降低发酵温度会明显减少糖耗速率和生长速率，延长杆菌肽合成时间来提高产量，34℃发酵温度下的效价最高点比37℃提高了13.5%，到达了1092 U/mL。

2)18 h前后分别34℃和37℃培养的阶段变温策略满足了杆菌肽合成对细胞数量，能量供应(中后期糖含量)和前体的需求，效价比对照(37℃培养)提高了24%，比34℃培养提高了9.2%，效价在29 h到达了最高点(1193 U/mL)。

该策略便于工艺控制，可以为工业生产提供重要参考。