过表达NF-κB对血管平滑肌细胞增殖与凋亡的影响

魏利超 吴 旻

血管平滑肌细胞(VSMCs)是正常血管壁结构的主要细胞成分，它能够通过协调血管的舒张和收缩功能而维持血管的张力和弹性，从而在调节血流量和血压的过程中发挥作用；心血管疾病的发生、发展与血管平滑肌细胞的功能改变密切相关[1]。血管壁的形态和结构并不是固定的，而血管壁重塑的重要细胞基础是VSMCs，当血管接受到生物信号或化学刺激时，VSMCs通过分泌的细胞外基质(ECM)维持基本的血管功能[2]。VSMCs表型的转化主要导致其结构和功能的改变，这种结构和功能的改变在动脉粥样硬化症、高血压和血管成型术后再狭窄等大多数心血管系统疾病的发展过程中发挥了关键的作用[3]。

核因子KappaB(NF-κB)是一种在真核生物细胞内普遍表达的转录因子，最初被发现时是一种可以与免疫球蛋白κ轻链基因的κ增强子结核的B细胞核蛋白。NF-κB含有一个由300个氨基酸构成的高度保守的N-末端区域，称为Rel-同源结构域(RHD)[4]。通过该结构域，不同的NF-κB成员可以相互作用形成各种同源或者异源二聚体并与靶基因的启动子或增强子区域中的κB序列元件结合，进而参与对靶基因的调节[5]。研究表明，NF-κB被激活后，即通过信号转导途径启动一系列联式翻译，可以促进多种细胞因子、黏附因子、化学因子和生长因子等的表达[6～9]。本研究通过上调NF-κB来研究其对血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响，为治疗动脉粥样硬化、血管成形术后在狭窄和其他血管增殖性病变提供新思路。

材料与方法

1.材料:人主动脉平滑肌细胞HA-VSMC购自中国科学院细胞库；质粒小提试剂盒和普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生物公司；Opti-MEM®和DMEM购自美国Gibco公司；L-谷氨酰胺购自中国Solarbio公司；超敏发光液购自美国Thermo Fisher Scientific公司；MTT细胞增殖试剂盒购自凯基生物；Lipofectamine®3000 购自美国Invitrogen公司；鼠单克隆抗体GAPDH购自中杉金桥公司；兔单克隆抗体NF-κB p65购自英国Abcam公司；NovoCyteTM流式细胞仪NovoCyte 2060R购自艾森生物(杭州)有限公司；蛋白垂直电泳仪购自美国Bio-Rad公司；超高灵敏度化学发光成像系统购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司。

2.载体构建：NCBI查找NF-κB基因的CDS序列，引入酶切位点(BstBI/BamHI)送通用生物合成cds区基因片段(克隆至plvxpuro载体)。质粒NF-κB-plvxpuro转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上培养过夜，抽提质粒并酶切验证。

3.实验分组：载体转染HA-VSMC细胞实验分为3组，即对照组、空载组和NF-κB过表达组。接种细胞至80%汇合度时转染，前一天接种或换液，取出质粒，使用Opti-MEM®培养基稀释，制备质粒DNA预混液，充分混匀。避光室温孵育5min。使用Opti-MEM®培养基稀释Lipofectamine®3000试剂-充分混匀，避光室温孵育5min。在每管已稀释的Lipofectamine®3000试剂中加入稀释的质粒DNA，室温避光孵育1h。加入DNA-脂质体复合物至细胞中。放入37℃，5%CO2培养箱孵育细胞。

4.MTT检测各组细胞的增殖情况:将HA-VSMC细胞接种于96孔板培养(约2×103个/孔)，置37℃ 5%CO2细胞培养箱培养24h；按照要求在相应的实验分组中加入NF-κB抑制剂IMD-0354；将96孔板在37℃ 5%CO2细胞培养箱继续孵育48h；将5×MTT用Dilution Buffer稀释成1×MTT；每孔加50μl 1×MTT，在37℃孵育4h，使MTT还原为甲臢；吸出上清液，每孔加150μl DMSO使甲臢溶解，用平板摇床摇匀；酶标仪在550nm波长处检测各孔的吸光度。

5.流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况：将细胞接种于6孔板，当细胞汇合度达到50%～70%时，按实验分组进行操作，48h后，离心收集各组细胞，细胞量为5×105个/组。用双蒸水稀释5×Binding Buffer为1×工作液，取500μl 1×Binding Buffer 重悬细胞。每管加入 5μl Annexin V-FITC 轻柔混匀后加入10μl PI，缓慢涡旋混匀后于室温下避光孵育5min。在流式细胞仪上，通过FITC检测通道(通常为FL1)检测Annexin V-FITC(Ex=488nm；Em=530nm)和通过PE检测通道(通常为FL2)检测 PI。

6.蛋白质印迹法检测各组细胞NF-κB的表达情况:收集转染72h后的各组细胞，用PBS洗涤细胞3次，加入细胞裂解液，冰上裂解30min后，4℃下10000r/min离心10min，小心吸取上清，获得各组细胞总蛋白。根据BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白煮沸变性后上样，再进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳1～2h后湿法转膜30～50min。4℃孵育一抗过夜；二抗溶液中室温孵育1～2h。最后通过滴加ECL曝光液，在凝胶成像系统中曝光。利用Quantity One软件进行各抗体条带灰度值的分析。

结 果

1.人主动脉平滑肌细胞的培养:HA-VSMC培养的细胞的生长状态良好，详见图1。

图1 日常细胞培养显微镜拍照(×100)

2.NF-κB过表达载体鉴定结果:用BstBI/BamHI对抽提的质粒NF-κB-plvxpuro进行双酶切(图2)，条带与理论值相符，证明质粒NF-κB-plvxpuro为正确质粒。

图2 酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测条带

3.NF-κB过表达载体转染验证:与对照组比较，NF-κB过表达组的NF-κB的表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.05，图3)。

图3 NF-κB过表达载体转染验证

4.MTT检测细胞增殖的结果:用MTT法检测各组HA-VSMC不同时间点的增殖情况，与对照组比较，NF-κB过表达组细胞的增殖率一直处于较低水平，差异有统计学意义(P<0.05)，详见图4。

图4 MTT检测细胞增殖的结果

5.流式检测细胞凋亡结果：流式细胞仪检测各组HA-VSMC细胞的凋亡情况，与对照组比较，NF-κB过表达组细胞凋亡明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，详见图5。

图5 流式细胞仪检测细胞凋亡的结果

讨 论

近年来，我国心脑血管疾病发生率不断增长，初步估计2016年我国心脑血管疾病患者人数约为2.9亿，心脑血管疾病死亡人数占居民疾病死亡人数40%以上，位居首位，高于肿瘤及其他疾病。心脑血管疾病已成为危害我国居民身体健康的重大疾病[10]。越来越多的研究表明，血管平滑肌细胞在血管壁发生病变时扮演着重要的角色[11]。转录因子NF-κB是一种调节炎症和免疫相关基因的转录因子[12，13]。已有研究证明NF-κB可以通过诱导microRNA从而影响血管平滑肌细胞的增殖与迁移[14]。

本研究目的旨在研究活化的NF-κB对血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响，通过构建NF-κB过表达载体来上调NF-κB的表达，通过MTT法和流式细胞仪来检测各组HA-VSMCs的增殖和凋亡情况。MTT结果显示,与对照组细胞比较，NF-κB过表达组细胞的增殖率一直处于较低水平，说明NF-κB被激活可以抑制HA-VSMC增殖。为验证MTT的结果，利用流式细胞仪来检测各组HA-VSMCs的凋亡情况，结果发现NF-κB过表达组细胞较正常对照组细胞的凋亡率偏高，其结果与MTT检测的结果一致，得出过表达NF-κB可以促进HA-VSMC凋亡，WB检测各组HA-VSMC细胞NF-κB表达情况，结果验证NF-κB过表达组作用于HA-VSMC细胞可以提高NF-κB的表达。

多项研究表明，NF-κB通路的激活介导TNF-α、IL-1和IL-6等促炎性因子的转录以及各种趋化因子的产生。这些可溶性因子与其特异性受体结合，诱导血管舒张以及单核细胞和中性粒细胞向炎症部位的迁移[15，16]。关于NF-κB介导的炎性反应在心脑血管疾病的发生、发展中的作用值得进一步探讨。本实验未做深入探究，这也是本研究的不足之处。血管平滑肌细胞的异常增殖是高血压、动脉粥样硬化等许多心脑血管病的主要病理特征，然而涉及参与其异常增殖、分化、迁移等过程相关分子机制却一直未见阐明。

综上所述，本研究通过对过表达NF-κB会抑制血管平滑肌细胞的增殖并促进血管平滑肌细胞的凋亡，为心脑血管疾病的基因靶向治疗的研究提供了方向。在后续研究中，对NF-κB影响血管平滑肌细胞增殖和凋亡机制进行深入探讨，为阐明血管平滑肌细胞异常增殖、分化、迁移等过程，也为治疗动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄和其他心脑血管增殖性病变提供新思路。