外源性HMGN2入胞并抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭

尹 佳 徐恩杰 马 骁 周许辉

骨肉瘤是一种源自间充质细胞的恶性骨肿瘤疾病，是儿童和青少年中最常见的恶性肿瘤之一[1]。骨肉瘤的特点是易早期转移，约15%～25%的患者在确诊骨肉瘤时可检测到肺部转移[2]。骨肉瘤的主要治疗方法为肿瘤切除术和非特异性联合化疗[3,4]。随着肿瘤治疗技术的发展，骨肉瘤患者的长期生存率有所提高，但合并远处转移的患者其生存率仍非常低[5,6]。寻找新的、更有效的骨肉瘤治疗靶点以降低肿瘤转移、改善患者的生存时间成为研究的重点。

HMGN2的异常表达与多种肿瘤相关[7,8]。HMGN2在乳腺癌的发生中发挥重要作用，能抑制膀胱癌细胞和口腔鳞状细胞癌细胞的生长并促进肿瘤细胞凋亡[9～13]。笔者之前的研究表明，在骨肉瘤细胞中以感染慢病毒的方式过表达HMGN2会抑制细胞的转移[14]。但目前慢病毒尚无法应用于临床治疗。

研究表明，某些细胞可以往细胞外分泌HMGN2[15]。笔者推测释放的HMGN2也具有抑制骨肉瘤转移的功能。此外，目前还没有研究解释HMGN2抗肿瘤功能的机制。本研究探索外源性HMGN2能否进入骨肉瘤细胞并抑制细胞的迁移和侵袭，并进一步探讨HMGN2在骨肉瘤细胞中的抗肿瘤机制。

材料与方法

1.材料：U-2 OS骨肉瘤细胞和HEK 293FT细胞购自中国科学院细胞库。慢病毒载体以及病毒包装质粒购自上海吉凯基因化学技术有限公司。PrimeSTAR HS DNA聚合酶、SYBR-Green预混液购自日本TaKaRa公司，反转录试剂盒购自美国Applied Biosystems公司，NE-PER核蛋白提取试剂盒购自美国Thermo Fisher公司，DMEM购自美国Hyclone公司，胎牛血清购自美国Gibco公司，McCoy′s 5a培养基、TRIzol试剂、Lipofactamine 2000、青霉素、链霉素购自美国Invitrogen公司，PVDF膜购自美国Millipore公司，牛血清白蛋、flag M纯化试剂盒、DAPI、结晶紫染色液购自美国Sigma-Aldrich公司，一抗及ELISA试剂盒购自英国Abcam公司，二抗购自美国CST公司，ECL曝光液购自美国Pierce公司，Trasnwell小室购自美国Coring公司。

2.细胞培养：DMEM培养基包含10%胎牛血清(FBS)、青霉素 (100U/L)和链霉素(100mg/L)。McCoy′s 5a培养基包含15% FBS、青霉素 (100U/L) 和链霉素 (100mg/L)。笔者选择两个骨肉瘤细胞系用于后续实验。将U-2 OS 骨肉瘤细胞在DMEM培养基中培养，将Saos-2 骨肉瘤细胞在McCoy′s 5a培养基中培养，在Saos-2细胞中重复从U-2 OS细胞实验中得到的迁移和侵袭的实验结果。将HEK 293 FT细胞在DMEM中培养。所有细胞均置于含5%CO2的37℃细胞培养箱中培养。

3.HMGN2的过表达和蛋白纯化：过表达慢病毒载体购自上海吉凯公司(GV492，元件顺序：Ubi-MCS-3flag-CBh-gcGFP-IRES-puromycin，中国上海)。用过表达慢病毒(HMGN2-flagoe组)和空白慢病毒(oeCON组)感染293FT细胞。通过预实验确定U-2 OS细胞病毒感染的最佳感染复数(MOI)为10，Saos-2的MOI为15，并基于该MOI值进行了正式实验。为了增加阳性细胞的比例，在细胞感染3天后进行流式分选，并继续培养带绿色荧光的细胞。当细胞培养至70%～80%融合率时，收集细胞并提取RNA，并通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)确认过表达效率。在确认HMGN2的过表达效率后，收集过表达HMGN2的细胞并使用NE-PER核蛋白提取试剂盒(美国Thermo Fisher公司)提取核蛋白，并应用flag M纯化试剂盒(美国Sigma-Aldrich公司)纯化HMGN2-flag蛋白。通过ELISA(ab49763，英国Abcam公司)确认HMGN2的浓度。

4.实时荧光定量PCR(RT-qPCR)：以SYBR-Premix Ex Taq(日本TaKaRa公司)和ABI Prism 7900HT(美国Applied Biosystems公司)进行RT-qPCR，以定量测定HMGN2、MMP-2、MMP-9、MMP-16的表达水平。应用TRIzol(美国Invitrogen公司)提取每组细胞的总RNA，使用Reverse Transcription试剂盒(美国Applied Biosystems公司)将mRNA转录成cDNA。使用特异性引物扩增基因，人β-actin基因为内参。使用的PCR引物序列为以下：HMGN2：正向引物：5′-CGATTGTCTGCCCATGTCCT-3′，反向引物：5′-GCAGAACGTACCCTGTTCCA-3′; MMP-2：正向引物：5′-TACAGGATCATTGGCTACACACC-3′，反向引物：5′-GGTCACATCGCTCCAGACT-3′; MMP-9：正向引物：5′-TGTACCGCTATGGTTACACTCG-3′，反向引物：5′-GGCAGGGACAGTTGCTTCT-3′; MMP-16：正向引物：5′-AGCACTGGAAGACGGTTGG-3′，反向引物：5′-CTCCGTTCCGCAGACTGTA-3′; β-actin：正向引物：5′-ACCGAGCGCGGCTACAG-3′，反向引物：5′-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3′。采用2-ΔΔCt法分析并统计数据。用相同的样品和相同的引物重复RT-qPCR实验3次。

5.Western blot法检测：使用NE-PER核蛋白提取试剂盒(美国Thermo Fisher公司)提取核蛋白，并使用蛋白质提取试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)提取总蛋白，并使用BCA蛋白质测定试剂盒(美国Pierce公司)测定蛋白浓度。获得的蛋白溶液在SDS-PAGE凝胶上电泳，分离的蛋白质条带转移到PVDF膜(美国Millipore公司)上，并在5%牛血清白蛋白(BSA，美国Sigma-Aldrich公司)中封闭。用对应的一抗在4℃下孵育过夜。使用的抗体如下：抗HMGN2(1∶1000稀释，ab199679，英国Abcam公司)，抗DDDDK(1∶1000稀释，ab49763，英国Abcam公司)、抗MMP2(1∶500稀释，ab97779，英国Abcam公司)、抗MMP9(1∶1000稀释，ab76003，英国Abcam公司)、抗MMP16(1∶500稀释，ab73877，英国Abcam公司)、抗LMNB1(1∶10000稀释，ab16048，英国Abcam公司)、抗β-actin(1∶10000稀释，ab8226，英国Abcam公司)。然后在室温下用二抗孵育膜1h。使用ECL曝光液(No.32106，美国Pierce公司)显影，并进行观察、拍摄。

6.免疫细胞化学：用浓度为10μg/ml的纯化HMGN2蛋白处理骨肉瘤细胞24h，然后将细胞用4%多聚甲醛固定30min，用0.1%Triton X-100的PBS溶液透化5min， 用1%BSA封闭细胞2h。将细胞在抗DDDDK抗体(1∶100稀释，ab49763，英国Abcam公司)中4℃孵育过夜。然后将细胞在带红色荧光的二抗(美国Cell Signaling Technology公司)中孵育1h， PBS洗涤后用DAPI(美国Sigma-Aldrich公司)封固。观察HMGN2-flag的细胞定位并使用共聚焦显微镜(德国Leica公司)拍摄。

7.划痕试验：在HMGN2-flag组中，用浓度为10μg/ml的纯化HMGN2-flag蛋白处理骨肉瘤细胞24h。对照组(UT组)加入等量的蛋白纯化洗脱缓冲液。之后将两组骨肉瘤细胞接种在6孔培养板中并生长至90%融合率。使用200μl微量移液管尖端建立划痕，监测细胞向划痕中心的迁移并拍照。迁移率(%)=(S0h-S24h或S48h)/ S0h×100%。S0h是建立的划痕宽度，S24h或S48h是建立划痕24h或48h后的宽度。

8.Transwell侵袭试验：细胞预处理方式同划痕试验。在6.5mm Transwell中测定细胞的侵袭能力差异。上室用涂覆50μl稀释的基质胶，下室加入500μl含10% FBS的DMEM培养基(或含有15%FBS的McCoy′s 5a培养基)。将细胞重悬于无血清培养基中并加入上室中。将细胞培养24h，除去未侵袭的细胞。用4%多聚甲醛固定侵袭细胞30min，然后用结晶紫染色液染色。计数侵袭细胞并统计分析。

结 果

1.HMGN2蛋白过表达与纯化：HMGN2过表达慢病毒质粒测序结果显示序列正确(图1A)。以慢病毒感染的方式在293FT细胞中过表达HMGN2，RT-qPCR结果显示HMGN2-flagoe组HMGN2-mRNA的表达水平显著高于oeCON组(图1B)。提取两组细胞的核蛋白，oeCON的总核蛋白为oeCON组，HMGN2-flagoe组的核蛋白利用flag标签进一步纯化，获得的纯化蛋白为HMGN2-flag组，通过Western blot法进行分析鉴定，结果显示使用抗HMGN2抗体两组中均检测到条带，且HMGN2-flag组的蛋白由于是携带flag标签的融合蛋白，其相对分子质量较oeCON组稍大(图1C)，使用抗DDDDK抗体在HMGN2-flag组和flag-BAP组中检测到条带，而在对照组中未检测到条带(图1D)。

图1 HMGN2蛋白过表达与纯化A.HMGN2过表达慢病毒质粒测序结果；B.RT-qPCR确认过表达效率；C.HMGN2-flag纯化和Western blot法检测。使用抗HMGN2抗体在HMGN2-flag组中检测到HMGN2。D.使用抗DDDDK抗体在HMGN2-flag组和阳性对照flag-BAP组中检测到条带。flag-BAP.携带flag标签的融合蛋白，相对分子质量为49.3kDa。oeCON组.oeCON组的核蛋白提取物;HMGN2-flag组.HMGN2-flagoe组的核蛋白经纯化后的带flag标签的蛋白

2.外源性HMGN2转运到骨肉瘤细胞和细胞核中：用浓度为10μg/ml的纯化HMGN2-flag蛋白处理骨肉瘤细胞24h，通过免疫细胞化学检测外源蛋白的细胞定位。结果显示，真核细胞表达的HMGN2可在处理24h后转运到骨肉瘤细胞的细胞核中(图2)。

图2 免疫细胞化学实验检测外源性HMGN2入胞及细胞定位(×1000)A.红色：HMGN2-flag融合蛋白；B.蓝色：细胞核；C.叠加效果

3.外源性HMGN2抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭：划痕试验结果显示HMGN2-flag组中骨肉瘤细胞的迁移显著低于UT组(图3中A～C)。Transwell侵袭试验显示，HMGN2-flag组中骨肉瘤细胞的侵袭较UT组显著降低(图3中D～E)。

图3 划痕试验和Transwell侵袭试验检测外源性添加HMGN2对骨肉瘤细胞迁移和侵袭的影响(结晶紫染色，×100)A.划痕实验及显微镜监测；B.两组在建立划痕后24h的迁移率统计分析；C.两组在建立划痕后48h的迁移率统计分析；D.Transwell侵袭试验及染色观察；E.计数两组侵袭细胞并统计分析

4.外源性HMGN2调节MMP-2和MMP-9的表达：通过RT-qPCR和Western blot法检测各组细胞内MMP-2、MMP-9和MMP-16的表达水平。RT-qPCR(图4中A～C)和Western blot法检测(图4D)结果显示HMGN2-flag组中MMP-2和MMP-9的表达水平显著低于UT组，而MMP-16的表达水平两组比较间差异无统计学意义。

图4 RT-qPCR和Western blot法检测两组MMPs的表达差异A～C.分别为两组间MMP-2、MMP-9、MMP-16的mRNA表达水平差异；D.两组间MMP-2、MMP-9、MMP-16的蛋白表达水平差异

讨 论

目前尚没有研究阐述HMGN2抗肿瘤功能的机制。笔者选择MMPs进行分析，是因为有较多研究显示MMPs受其他HMGN家族成员调控，并与肿瘤转移相关[16-19]。大约有20%的骨肉瘤患者在初次诊断时即发现有转移，而25%～50%的患者则随着病情发展出现转移[20]。骨肉瘤的主要治疗方法是化疗和外科手术，然而即使在手术切除和化疗后，这些患者中的大多数最终会发生转移并死亡。大约90%的骨肉瘤患者在手术切除原发肿瘤后出现转移或复发[21]。因此，亟需要开发抗骨肉瘤转移的新型治疗方案。

在肿瘤转移中起重要作用的高迁移率族蛋白(HMG)包括HMGA，HMGB和HMGN。HMGNs主要定位于细胞核中且仅在真核生物中表达，含有核小体结合域(NBD)，HMGN2是HMGN家族的成员。早期研究表明，HMGN2是一种非组蛋白核蛋白，在脊椎动物和无脊椎动物的细胞中广泛表达，它具有稳定核小体形态和调节基因转录的功能，其NBD的N末端与组蛋白结合，而C末端与DNA结合并调节转录[22]。HMGN2缺陷型DT40细胞对紫外线敏感，细胞凋亡率增加，表明HMGN2在DNA损伤修复中发挥作用[23]。多项研究表明HMGN2的异常表达与多种肿瘤有关，并视为一类抗肿瘤因子[7～12]。已有研究证明HMGN2可抑制口腔鳞状细胞癌细胞系Tca8113的生长并诱导细胞凋亡[13]。笔者之前的研究表明，以慢病毒感染的方式在骨肉瘤细胞中过表达HMGN2会抑制细胞的转移[14]。然而，目前慢病毒不适用于临床治疗。

IL-2刺激人外周血单核细胞释放HMGN2。舌鳞状细胞癌抗原刺激CD8+T淋巴细胞释放HMGN2[15]。为探讨外源性HMGN2是否能进入骨肉瘤细胞，本研究纯化了HMGN2-flag融合蛋白，并在骨肉瘤细胞培养基内添加该融合蛋白，通过免疫细胞化学(ICC)检测蛋白定位。结果显示外源性HMGN2能进入骨肉瘤细胞并最终位于细胞核中。为了了解外源性HMGN2是否抑制骨肉瘤细胞转移，本研究用纯化的HMGN2蛋白处理骨肉瘤细胞，并通过划痕试验和Transwell侵袭试验检测各组骨肉瘤细胞迁移和侵袭的差异。结果表明，外源性HMGN2进入细胞可抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭。这些结果可为抗肿瘤药物的研究提供新的思路。

研究表明HMGN2具有抗肿瘤活性。肿瘤转移抑制和肿瘤靶向肽研究表明HMGN2可能是治疗肿瘤转移的潜在靶标。研究人员从牛肝中提取了21个氨基酸的肽，称为侵袭抑制剂2(IIF-2)，其被鉴定为与HMGN2的C末端片段一致。体外研究显示该肽抑制多个肿瘤细胞的转移。而动物研究表明，同时将IIF2和肺癌细胞注射到小鼠尾静脉可使转移较对照组减少50%～60%。IIF-2与白蛋白结合可提高其稳定性，并使转移形成减少86%。此外，Porkka等还发现HMGN2还与肿瘤血管生成相关，从而影响肿瘤转移。然而，目前还没有研究解释HMGN2抗肿瘤功能的机制。

目前已经在几乎所有类型的人类癌症中检测到了MMPs的激活，并且与肿瘤侵袭、转移以及较差的存活时间密切相关。有证据表明HMGN家族成员能调节MMPs的表达，并在肿瘤转移中发挥重要作用[16～19]。在开始本项研究前，笔者推测HMGN2可能通过下调MMPs来发挥抗肿瘤作用。而本研究结果表明，外源性HMGN2能下调MMP-2和MMP-9的表达，并在抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭中发挥作用。

本研究证实了外源性HMGN2在骨肉瘤细胞中的抗肿瘤作用。然而，研究结果还需要大量的体内实验结果来进一步证实。在下一步研究中将HMGN2和骨肉瘤细胞同时注射到裸鼠的尾静脉中，以进一步确定外源性HMGN2抗肿瘤转移的作用。

综上所述，在之前的研究中证实了过表达HMGN2在人骨肉瘤细胞系中表现出抗肿瘤活性。而本研究显示，外源性HMGN2能进入骨肉瘤细胞并调节骨肉瘤细胞中MMP-2和MMP-9的表达，最终有助于抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭。这些结果为骨肉瘤抗转移药物的研发提供了新思路，HMGN2类似物或刺激细胞HMGN2释放的药物可作为药物研发的备选。