小檗碱通过NF-κB相关通路抑制AGEs诱导的小鼠小胶质细胞活化的实验研究

万瑾舒 顾 蓓 刘玉琴 南凤尾 张孟仁

神经炎性反应是糖尿病认知功能下降的重要机制，减轻或有效抑制炎性反应可能是防治糖尿病认知功能障碍的重要途径[1～3]。有研究表明，高糖状态下，体内炎性因子水平的升高可能与小胶质细胞中非酶糖基化产生过多的晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)，从而引发晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products，RAGE) 相关的胞内炎性信号通路有关[4，5]。AGEs可以与细胞表面 RAGE 结合，激活胞内炎症信号通路并产生活性氧，同时，核转录因子 κB (nuclear factor-kappaB，NF-κB)磷酸化后入核，启动下游基因转录，进而诱发炎症，导致炎性因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-6 (interleukin-6，IL-6) 的释放，从而对神经细胞造成损伤[6,7]。

黄连(Rhizoma Coptis)，属毛茛科、黄连属多年生草本植物， 是笔者课题组自拟中药复方脑复聪的主要成分之一，现代药理研究表明其具有抗炎、抗氧化、降糖、降脂等作用，小檗碱(berberine)是其主要的有效成分之一。本研究通过研究小檗碱对 AGEs 诱导小胶质细胞活化后引发的炎性反应的作用，探讨小檗碱在糖尿病认知功能障碍中发挥神经保护作用的可能机制。

材料与方法

1.材料：小鼠小胶质BV-2细胞细胞株购自北京协和医学院基础学院细胞中心，编号:3111C0001CCC000063。RPMI-1640液体培养基、胎牛血清(FBS)、MTT(美国Sigma公司)，盐酸小檗碱(百灵威科技有限公司)，AGEs蛋白质(北京博奥森有限公司)，DMSO(北京化工厂)，Anti-CD68抗体(ab53444，英国Abcam公司)，Anti-RAGE抗体(ab181293，英国Abcam公司)，pNF-κBp65 抗体(#3033T，美国CST公司)，TNF-α ELISA试剂盒(美国eBioscience 公司)，AGEs-BSA(美国Biovision公司)，Tris、APS、SDS、TEMED、Tween-20、丙氨酰胺、甘氨酸、甲叉双丙烯酰胺、丽春红(美国Sigma公司)，ECL Plus 超敏发光液(美国Millipore公司)，羊抗兔HRP 标记的二抗、羊抗大鼠HRP 标记的二抗(美国Jackson公司)。倒置相差显微镜(日本Olympus公司)，ELX 800 酶标仪(美国BioTek公司)，全自动多功能酶标仪(美国Thermo公司)，CO2培养箱(美国Forma3111公司)，自动洗板机(美国Thermo公司)，电热恒温培养箱(中国DH4000A)，GL-802B微型台式真空泵、MINI shaker、摇床(中国其林贝尔公司)，台式冷冻离心机(中国湘仪公司)，电泳仪、转膜仪(中国J-MAX公司)。

2.方法：(1)细胞培养：小鼠小胶质细胞BV-2以含10%FBS的RPIM1640培养基培养在37℃含5%CO2的细胞培养箱内，隔日换液1次，隔2～3日传代一次(细胞长至70%～80%时传代)。(2)细胞给药与分组：取对数生长期BV-2细胞以3×104/ml的密度接种于6孔培养板，待细胞贴壁后，吸弃旧培养基，然后按分组更换培养基后继续培养约24h后继续后续实验，(3)分组情况：Con组培养基为无血清的 RPMI1640 培养基，AGEs组为无血清的 RPMI1640 培养基+AGEs(终浓度为 300μg/ml)，小檗碱组更换为 10μmol/L 小檗碱预处理1h后再更换为 300μg/ml AGEs 培养基培养 23h，BSA阴性对照组为无血清的 RPMI1640 培养基+BSA(终浓度为 300μg/ml)。(4)细胞形态观察及ELISA检测：更换培养基继续培养24h后倒置相差显微镜下观察各组细胞形态学变化并摄片。细胞形态观察结束后提取细胞上清液，采用TNF-α ELISA试剂盒检测各组细胞上清液中TNF-α 含量。(5)细胞活力检测：取对数生长期BV-2细胞以3×103/孔的密度接种于96孔培养板中，每孔加含10%FBS的RPMI1640培养基约100μl，每组设8个平行孔，外周1圈空白孔内加100μl 0.01mmol/L PBS做空白对照，细胞贴壁后按上述实验分组给药继续培养24h后采用MTT对细胞活力进行检测，选择570nm波长在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度(A)值，记录并分析结果。(6)Western blot法检测：采用Western blot法对各组细胞中CD68、RAGE、pNF-κB p65蛋白进行检测，蛋白相对表达量用各目的蛋白灰度值与相应内参(actin)灰度值的比值表示。

结 果

1.小檗碱对小胶质细胞BV-2形态的改变:显微镜下可见:常规对照组细胞 50%～60%贴壁良好，胞体呈梭状或三角状，约 40%悬浮生长。AGEs 组细胞贴壁数量较Con组增多，约70%～80%贴壁，部分细胞活化为胞体较大、突起缩短的阿米巴样类巨噬细胞(图1)。BSA 对照组与Con组比较悬浮细胞比例相似，并且没有出现阿米巴样细胞，提示 AGEs 对小胶质细胞形态的改变与其蛋白属性无关。小檗碱组较AGEs 组阿米巴样细胞数目减少，多为梭形或三角状细胞，提示小檗碱对 AGEs 导致的形态学改变有一定的恢复作用。

2.小檗碱对小胶质细胞BV-2细胞活力的影响:与Con组比较，AGEs组、小檗碱组及BSA组与Con组之间A值比较，差异无统计学意义(P>0.05)，详见图2。

3.小檗碱对小胶质细胞上清液中TNF-α分泌量的影响:与Con组比较，AGEs组上清液中TNF-α分泌量显著升高(P=0.000)；与AGEs组比较，小檗碱组细胞上清液中TNF-α分泌量差异无统计学意义(P>0.05)；与Con组比较，BSA阴性对照组上清液中TNF-α分泌量差异无统计学意义(P>0.05)，详见图3。

图1 不同培养条件下小胶质细胞倒置相差显微镜下形态观察(×40)A.Con组;B.300μg/ml AGEs 组;C.小檗碱组;D.BSA 对照组

图2 各组小胶质细胞BV-2细胞活力比较(n=24)A.Con组;B.300μg/ml AGEs 组;C.小檗碱组;D.BSA 对照组

图3 不同组小胶质细胞上清液中TNF-α分泌量(n=4)A.Con组;B.300μg/ml AGEs 组;C.小檗碱组;D.BSA 对照组

4.小檗碱对小胶质细胞CD68、RAGE、pNF-κB p65蛋白表达的影响:与Con组比较，AGEs组小胶质细胞中CD68、RAGE及pNF-κB p65蛋白的表达量均明显升高(P<0.01，P<0.05，P<0.01)，小檗碱组CD68、pNF-κB p65蛋白的表达量均较AGEs组显著下降(P<0.01，P<0.05)，RAGE蛋白的表达量与AGEs组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，详见图4。

图4 小檗碱对小胶质 细胞CD68、RAGE、pNF-κB p65 蛋白表达的影响

讨 论

多项研究表明，AGEs 与糖尿病认知功能障碍关系密切，2 型糖尿病认知功能障碍患者血清 AGEs 水平明显高于糖尿病非认知功能障碍患者[8，9]。AD 样变病理改变是认知功能障碍的重要病理基础，AGEs 与 AD 样病理改变的发生、发展亦关系密切。AGEs 不仅常与 Aβ 共同沉积在AD患者/动物模型神经细胞外，同时参与并增加 Aβ 的错误折叠[10]。另外，Aβ-AGEs 复合物可通过 RAGE 相关信号通路加重 Aβ 的神经毒性作用[11]。Tau 蛋白过度磷酸化方面，在 AD 患者的神经原纤维缠结处同样可检测到 AGEs 的表达，另外，AGEs亦可通过RAGE介导的糖原合成酶3(glycogen synthase kinase 3，GSK-3)激活诱导 AD 样 tau 蛋白改变[12]。上述研究均表明AGEs 与糖尿病认知功能障碍关系密切，在认知功能障碍发病过程中发挥重要作用，故本研究选用AGEs 为小胶质细胞激活剂，模拟高糖状态下神经系统的炎症激活后的细胞状态。预实验过程中通过观察不同浓度下小胶质细胞细胞形态学变化、MTT、细胞免疫荧光及ELISA 检测结果，同时结合相关文献报道，笔者最终采用了 300μg/ml 作为 AGEs 实验干预浓度。

有研究表明，AGEs可以与细胞表面RAGE结合，激活胞内炎症信号通路并产生活性氧，同时，NF-κB磷酸化后入核，启动下游基因转录，进而诱发炎症，导致炎性因子 TNF-α、IL-6 的释放[4，5]。本实验结果显示AGEs 能显著上调小鼠小胶质细胞表面白细胞分化抗原68(cluster of differentiation 68,CD68)、RAGE、pNF-κB p65蛋白的表达，增加炎性因 子TNF-α的分泌量。本实验的研究结果与其相一致。但AGEs 诱导的小胶质细胞激活及炎性因子释放其具体机制到底是 AGEs 直接激活小胶质细胞导致 CD68 的表达增高，从而激活 RAGE/NF-κB 通路，增加炎性因子的释放还是 AGEs 与其受体 RAGE 结合激活其下游 NF-κB 通路激活使炎性因子升高从而导致小胶质细胞的激活尚不清楚。该信号转导通路中各信号分子之间相互影响的具体过程及机制尚待进一步分子生物学研究阐明。

根据认知障碍的中医病因病机特点及治疗认知障碍的临床经验并参考现代药理学的研究，笔者设计的中药复方脑复聪临床应用对脾肾亏虚、痰浊血瘀型轻度认知功能障碍的患者有良好疗效[6]。既往研究表明脑复聪能够增加海马CA1区胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的含量，下调糖尿病认知功能障碍大鼠海马 CA1 区NF-κB的表达水平、有效抑制高糖条件下小鼠小胶质细胞的活化，NF-κB 的活力及 NF-κB p65 的表达，显著下调 BV-2 上清液中的 IL-6、TNF-α 蛋白和 BV-2 中 IL-6-mRNA、TNF-α-mRNA 的表达[6，7]。

黄连作为该复方的组成药物之一，其主要有效成分小檗碱在脑缺血、阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化、糖尿病认知功能障碍等多种中枢神经损伤性疾病中均能起到一定的神经保护作用[13]。因此，本实验选用中药黄连的有效成分小檗碱作为研究药物。综合小檗碱对小胶质细胞活化的抑制作用及其对炎性因子pNF-κB p65蛋白的下调作用，参考文献[14～16]，本研究最终采用了 10μmol/L 的作用浓度。

本实验研究结果显示小檗碱对 AGEs 导致的细胞上清液中 TNF-α 的升高无明显降低作用，这与于希忠等[17]和Lu等[18]所报道的小檗碱能抑制炎性反应、降低 TNF-α含量的研究结果不一致，推测实验结果不一致的原因可能为小檗碱预处理时间不足或者更换培养基的过程使得细胞上清液中能降低 TNF-α 的有效成分流失有关。Western blot法检测结果显示，小檗碱可以显著下调AGEs 培养的小胶质细胞CD68和pNF-κB p65 蛋白的表达，说明小檗碱可以抑制300μg/ml AGEs 培养条件下小鼠小胶质细胞的活化，其原因可能与其调控 NF-κB 相关信号通路有关。

本研究结果提示小檗碱可以通过抑制AGEs诱导的小鼠小胶质细胞的活化发挥神经保护作用，但具体机制尚待进一步实验明确，希望能为探讨小檗碱作为糖尿病认知功能障碍的防治药物的可能机制及潜在靶点提供参考。