两株野生鸡腿菇分离鉴定及生物学特性研究

2020-10-25张秀伟牛力立蔡甫格曹家洪张万萍

食用菌 2020年5期

张秀伟牛力立蔡甫格鲍菊曹家洪张万萍

（安顺市农业科学院生物技术研究所，贵州安顺561000）

鸡腿菇学名毛头鬼伞（Coprinus comatus），属于担子菌亚门、伞菌纲、伞菌目、伞菌科、鬼伞属，是一种珍稀食用菌[1]，被定为符合联合国粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）要求的，集天然、营养、保健三种功能为一体的16种珍稀食用菌之一[2]。

鸡腿菇是一种世界性分布的菌类，野生菌多分布在我国北方省份，在贵州很少见。研究针对贵州当地的2 株野生鸡腿菇（图1、图2）进行分离鉴定，并对其生物学特性进行研究，为选育具有自主知识产权的地方品种提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 供试材料

野生鸡腿菇菌株：试验菌株于2018 年5 月、10月采自贵州安顺市草坪地，组织分离后保存菌种，编号为MT-1、MT-2。菌种现保存在安顺市农科院分子生物实验室。

1.2 试验方法

1.2.1 形态学鉴定

参照《多彩的蘑菇世界：东北亚地区原生态蘑菇图谱》[3]进行初步形态鉴定。

图1 野生MT-1

图2 野生MT-2

1.2.2 ITS序列分析及鉴定

利用CTAB 法提取2 个菌株的DNA，以ITS5（5′-GGAAAAGTCGTAACAAGG-3′）为正向引物，ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）为反向引物（引物浓度1 nmol/L 加100 μL 水），进行扩增。PCR 反应体系（25 μL）：2×Taq PCR Mastermix [天根生化科技（北京）有限公司]12.5 μL，引物 ITS5 和ITS4 各 1 μL，菌株 DNA1 μL，超纯水补足 25 μL。PCR 程序为：95 ℃预变性5 min，开始循环，95 ℃变性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃复性 8 s，33 个循环，72 ℃延伸7 min。扩增后产物由北京赛诺生物有限公司进行DNA 测序，测定的结果在Gen Bank 上，运用Blast进行同源性比对。

1.2.3 菌丝培养温度试验

制备PDA 平板培养基，取直径5 mm 的两菌株菌块接入平板中间，于 5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃、35 ℃的恒温培养箱中培养。培养10 d 用十字交叉法分别测其菌落直径，并观察菌丝长势。每个处理3次重复。

1.2.4 培养基pH试验

用NaOH（1 mol/L）和HCl（1 mol/L）将PDA 培养基的pH 分别调至4、5、6、7、8、9、10、11，制备PDA 平板后，接入直径5 mm 两菌株菌块，于25 ℃恒温箱内培养10 d，测量菌落直径（方法同1.2.3）。每个处理重复3次。

1.2.5 培养基碳源、氮源试验

以真菌生理培养基[4]（氮源1 g，碳源5 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O0.5 g，琼脂 20 g，蒸馏水1 000 mL）为基础。以KNO3为氮源，配制以甘露醇、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、无碳源（CK）的碳源试验培养基；以蔗糖为碳源，配制以硫酸铵、硝酸铵、酵母膏、蛋白胨、硝酸钾、硝酸钠、无氮源（CK）的氮源试验培养基。将直径5 mm 的菌块接入试验培养基，于25 ℃恒温培养箱内培养10 d，测量菌落直径（方法同1.2.3）。每个处理重复3次。

1.2.6 光照试验

取直径5 mm 的菌块，接入PDA 培养基平板中，于全光照（24 h 光照）、半光照（12 h 光照，12 h 黑暗）、全黑暗（24 h 黑暗）条件，25 ℃恒温培养10 d。菌落直径测定方法同1.2.3。每个处理重复3次。

1.2.7 栽培试验

用培养好的两菌株麦粒原种，接种在棉籽壳50%，玉米芯34%，麸皮10%，石灰3%，石膏1%，钙镁磷酸肥1%，糖1%的培养料上，菌丝长满袋后出菇管理。两个菌株分别制作18个菌袋，框栽每框放置3 袋，2 框为一个小区，重复3 次。记载菌丝出土期（覆土层布满菌丝的时间）、原基形成期（覆土层出现大量原基时间）、采收期（子实体五六分熟时，菌环刚松动时）。统计产量（kg/小区），计算生物学效率。

2 结果与分析

2.1 野生鸡腿菇MT-1、MT-2的形态特征

根据野生子实体形态特征，参照《多彩的蘑菇世界：东北亚地区原生态蘑菇图谱》[3]初步确定两株真菌均为毛头鬼伞。

2.2 野生鸡腿菇MT-1、MT-2的ITS序列分析及鉴定

采用CTAB 法，提取两株野生食用菌的DNA，用ITS5 为正向引物，ITS4 为反向引物，进行扩增。扩增结束后，邮寄至北京赛诺生物有限公司进行测序，测序结果如下：

MT-1、MT-2 序列全长分别为668 bp、667 bp。通过 GenBank BLAST 比对发现，MT-1、MT-2 与鬼伞属的毛头鬼伞最大同源性高达100%、99.38%，结合子实体形态特征，将两种真菌鉴定为毛头鬼伞。

2.3 供试碳源对MT-1、MT-2菌丝体生长的影响

由表1 可以看出，供试碳源培养基上两株鸡腿菇菌丝均能生长，菌落圆形、灰白色。最佳碳源为甘露醇，MT-1、MT-2 的菌丝浓密，菌落直径分别为6.43 cm、4.98 cm，与其他碳源培养基菌落直径差异显著。在以乳糖为碳源的培养基上两菌株菌丝长势最差，菌落直径最小。

葡萄糖、麦芽糖两处理间，MT-1 菌落直径无显著性差异，与其他碳源处理差异显著。葡萄糖、麦芽糖或无碳源（CK）三处理间，MT-2 菌落直径无显著差异。

表1 供试碳源对MT-1、MT-2菌丝体生长的影响

同一碳源培养基上，MT-1 的菌落直径均大于MT-2的直径。

2.4 供试氮源对MT-1、MT-2菌丝体生长的影响

由表2 结果可以看出，培养基有无氮源两个菌株菌丝均能生长，菌落灰白色、圆形。MT-1、MT-2培养基最佳氮源均为蛋白胨，菌落浓密，直径分别为7.72 cm、8.48 cm。

氮源为蛋白胨或NH4NO3，MT-1 菌落直径排前二，两者间无显著性差异，两者与其他氮源培养基差异显著；含有硝基氨培养基上的菌落稀疏，长势较差；氮源为酵母膏培养基，MT-1 菌落直径位列第三，与其他氮源培养基差异显著。

MT-2 在以NH4NO3为氮源的培养基上，菌落直径位列第二，与其他氮源培养基差异显著。

2.5 pH对MT-1、MT-2菌丝体生长的影响

由表3结果可以看出，两个菌株对培养基pH 适应范围较广，pH4～11 菌丝均能生长，菌落均呈灰白色、圆形。试验pH范围内，随着培养基pH上升菌落扩展速度加快，pH7 时 MT-1、MT-2 菌落达最大值，分别为10.61 cm、10.40 cm。

表2 供试氮源对MT-1、MT-2菌丝体生长的影响

表3 pH对MT-1、MT-2菌丝体生长的影响

MT-1 菌落直径，培养基 pH7 与其他 pH 处理间差异显著；培养基pH4、pH5、pH6、pH8、pH9 四处理间MT-1菌落直径无显著性差异。

MT-2 菌落直径，培养基 pH5、pH6、pH7 三者间无显著性差异，与其他pH 处理差异显著；pH8 与pH9无显著性差异；pH10与pH11无显著性差异。

2.6 培养温度对MT-1、MT-2菌丝体生长的影响

由表4可以看出，在试验最低温度（5 ℃）和最高温度（35 ℃）两个菌株菌丝体均不能生长，温度25 ℃时MT-1、MT-2 菌落直径最大，分别为8.68 cm、8.60 cm。培养温度在30 ℃时菌丝生长速度下降，MT-1、MT-2 的菌落直径分别为 8.47 cm、5.93 cm。由此可见，MT-1菌株相比MT-2更耐高温。

2.7 光照对MT-1、MT-2菌丝体生长的影响

由表5 可见，光照对两菌株菌丝体的生长有抑制作用，在全黑暗条件下菌丝生长速度最快，菌丝浓密，MT-1、MT-2 的菌落直径分别为8.6 cm、8.5 cm，与其他两个光照处理差异显著；在全光照下两菌株菌丝体生长最慢，且菌丝稀疏。

表4 培养温度对MT-1、MT-2菌丝体生长的影响

表5 光照对MT-1、MT-2菌丝体生长的影响

图3 人工栽培MT-1

2.8 两菌株栽培结果

表6 MT-1及MT-2覆土栽培结果

由表5可见，覆土后MT-1、MT-2菌丝出土时间一致，均为9 d，菌丝洁白健壮。MT-1 现原基（17 d）比MT-2（20 d）早，采收时间也早。MT-1、MT-2 的生物学效率分别为73.78%、54.54%。

3 小结与讨论

子实体形态特征与ITS 序列分析相结合鉴定结果，获得两株野生菌为毛头鬼伞。

对两株鸡腿菇菌丝体生物学特性的研究表明，有机氮源更利于两菌株菌丝生长；甘露醇为两个菌株菌丝生长的最佳碳源，与朱玉兰等研究结果不同[5]，可能为菌株个体差异；乳糖为碳源培养基菌丝长势最差，与曹晋良等试验结果相似；两菌株培养基最适pH 为7，与以往研究不同[6-9]，表明来自不同地区野生鸡腿菇菌株对培养基pH 要求是有差异的。两菌株菌丝生长对温度及光照要求与前人相关研究结果一致。