经多色流式细胞术确诊多发性骨髓瘤并发恶性胸腔积液6例临床特征分析

王梦园 马莉 管俊

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）为血液系统发病率位居第二位的恶性肿瘤，是起源于B细胞的恶性克隆性浆细胞疾病。通常骨髓瘤细胞仅局限于骨髓，但其也可扩散并渗透到其他部位，如胸膜、淋巴结和肺脏等［1］，从而产生恶性胸腔积液（malignant pleural effusion，MPE）。本研究主要探讨由更为敏感的多色流式细胞术（flow cytometry，FCM）确诊的6 例MM并发MPE患者的临床特点、实验室指标和转归情况，旨在强调FCM 对MPE 的诊断价值及增加对MM并发MPE患者临床特点的认识。

1 材料与方法

1.1 病例资料

分析2016年7月至2019年10月江苏省苏北人民医院经FCM诊断的6例MM并发MPE患者，其中男性4 例，女性2 例，年龄范围49～72 岁，中位年龄62岁。MM的诊断标准采用国际骨髓瘤工作组（IMWG）指南。胸腔积液的诊断标准为影像学检查（胸部X线、胸部CT或超声）发现胸腔积液同时行胸腔穿刺检查。MPE的诊断则依据胸水脱落细胞学检查和（或）FCM 检查。按照Durie-Salmon（DS）分期体系及国际分期系统（ISS）进行分期，按照血清肌酐水平分组。

1.2 方法

1.2.1 资料收集 收集患者的临床资料，包括年龄、性别、分期、分型和出现胸腔积液的时间以及随访截至2020年5月1日患者的总生存时间，同时收集患者的实验室指标，胸水常规、生化及脱落细胞学检查，对所有胸腔积液进行FCM检测。

1.2.2 主要试剂及仪器 CD38-FITC/CD56-PE/CD19-PerCP/CD138-APC、CD138-FITC/CD117-PE/CD28-PerCP/CD27-APC、CD200-PE/CD45-PerCP/CD138-APC、κ-FITC/λ-PE/CD138-APC、溶血素、破膜剂，上述试剂均购自美国贝克曼库尔特公司。Dx⁃FLEX流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司。

1.2.3 实验方法 多色流式细胞法：取新鲜胸腔积液200～500 mL，过滤后以肝素抗凝，以1 000 r/min的速度离心5 min，弃上清液，PBS洗涤2次，细胞沉淀用PBS制成细胞浓度为106/mL的单细胞悬液，分成5管，分别加入100 mL单细胞悬液，1管为空白对照，2、3、4 管 加 入CD38- FITC/CD56- PE/CD19- PerCP/CD138-APC、CD138-FITC/CD117-PE/CD28-PerCP/CD27-APC、CD200-PE/CD45-PerCP/CD138-APC、κ-FITC/λ-PE/CD138-APC 抗体各10 μL，充分混匀，于室温避光孵育15 min，加入1∶9 配制的溶血素2 mL，避光8 min 后，以1 000 r/min 的速度离心5 min，弃上清液，PBS 缓冲液0.5 mL 再悬浮细胞。第5 管加入1号固定剂，于室温避光孵育15 min，加1 mL PBS缓冲液震荡，以1 000 r/min 的速度离心5 min，弃上清液，加入2 号固定剂，静置5 min，加入κ-FITC/λ-PE/CD138-APC 抗体各10 mL，充分混匀，于室温避光孵育15 min，加1 mL PBS 缓冲液震荡，以1 000 r/min 的速度离心5 min，弃上清液，PBS缓冲液0.5 mL再悬浮细胞，用DxFLEX 流式细胞仪进行检测，采用Cytex⁃pert 软件获取与分析数据。建立FSC/SSC，每管获取20 000个细胞，根据同型对照分析。检测细胞CD19、CD38、CD45、CD56、CD138和κ、λ的表达情况。

脱落细胞学检查：取胸腔积液标本10 mL，1 500 r/min离心5 min，弃上清液留取沉淀物，混匀后制片，经自然干燥后用瑞－姬染色，光镜下进行细胞学分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。研究中连续变量以±s表示，分类变量以率（构成比）表示，相关性分析双变量正态分布采用Pearson 相关性分析，不符合双变量正态分布采用Sperman 相关性分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征

按照ISS 分期：Ⅰ期1 例，Ⅱ期4 例，Ⅲ期1 例。DS 分期：Ⅰ期1 例，Ⅱ期2 例，Ⅲ期3 例。6 例患者均为A 组。分型：IgA-κ 型1 例，IgG-κ 型1 例，IgA-λ 型2例，IgG-λ型1例，κ轻链型1例。其中4例为早发性渗出，另外3 例为迟发性渗出，早发性渗出被定义为在MM 诊断时或在第1 个化疗周期发生的渗出。迟发性渗出是指在第1个周期化疗后发生的渗出［2］，见表1。

2.2 胸腔积液特征

2.2.1 胸腔积液部位及性质 6例MPE患者中，所有患者均出现双侧大量胸腔积液，胸腔积液颜色1例为红色，1例为浅黄色，4例为黄色。李凡他试验中4例阳性，2例弱阳性。6例胸水中乳酸脱氢酶（lactate de⁃hydrogenase，LDH）水平76～1 328 U/L（中位88 U/L），腺苷脱氨酶（adenosine deaminase，ADA）0～51 U/L（中位45 U/L），白细胞17×106～742×106/L（中位135.5×106/L），单个核细胞数13×106～680×106/L（中位124.5×106/L）。6 例患者行胸腔积液脱落细胞学检查，镜下见淋巴细胞等炎症细胞及间皮细胞，均未见癌细胞。

用多色流式细胞仪对6 例患者的胸水进行免疫表型分析，表达的浆细胞分别占有核细胞数的59.10%、0.71%、1.34%、1.90%、0.38%和29.80%。表2总结了6例患者的胸水骨髓瘤细胞免疫表型。

2.2.2 胸水浆细胞百分比与常规实验室指标相关性分析 分析6 例经FCM 确诊的MM 并发MPE 患者胸水浆细胞比例与常规实验室指标，结果显示胸水浆细胞比例与胸水总蛋白、白蛋白、球蛋白、LDH水平、ADA 及初诊时骨髓浆细胞比例成正相关（P<0.05），与胸水常规红细胞数、单个核细胞数、白细胞数以及血清血红蛋白、血小板、总蛋白、白蛋白、LDH 水平、ADA、β2-微球蛋白均无明显相关性（P>0.05）。见图1，表3。

2.3 治疗及转归

随访截至2020年5月1日，共有4 例（66.7%）MPE 患者死亡，2 例（33.3%）患者存活。病例1 在确诊MPE 17 个月后死于疾病进展。病例2 在第1 次PAD（硼替佐米+多柔比星+地塞米松）方案化疗中出现MPE，经3 个疗程PCD（硼替佐米+环磷酰胺+地塞米松）方案治疗后，胸腔积液基本消失，此后患者未予治疗，4 个月后疾病进展，最终死于浆细胞白血病。病例3 出现心肌淀粉样变，给予PTD 方案（硼替佐米+沙利度胺+地塞米松）化疗后胸水未消失，通过FCM找到异常浆细胞，后改为PCD方案，最终死于疾病进展。病例4 入院时即存在MPE，经过2 个疗程PTD 方案治疗后，患者出现呼吸心跳骤停，心肺复苏后转入重症监护室，最后死亡。病例5 在第1 次PCD方案化疗结束后出现MPE，后改为BRD方案（硼替佐米+来那度胺+地塞米松），因出现全身广泛皮疹，考虑来那度胺过敏，给予BD 方案（硼替佐米+地塞米松）化疗，胸腔积液未消失，后未于本院治疗，目前仍然生存。病例6经2个疗程PCD方案后，胸腔积液基本消失，第3 个疗程结束后骨髓示缓解期骨髓象，游离轻链阴性，后行第4 个疗程PCD 方案化疗，游离轻链转阳性，患者要求转入当地医院治疗，截至随访结束日期仍然生存。

表2 6例MM并发MPE患者的胸水免疫表型特征

图1 病例6胸水流式分析散点图

表3 胸水浆细胞比例与实验室指标相关性分析

3 讨论

MM为一种浆细胞恶性增殖性疾病，主要表现为CRAB 症状：高钙血症、肾衰竭、贫血和溶骨性损害，但也有约6%MM患者出现以胸腔积液为主要表现的呼吸困难［3］。MM合并胸腔积液产生的原因主要为邻近骨骼或肿瘤的胸膜腔受累、纵隔淋巴结浸润伴淋巴阻塞、胸膜或肺淀粉样变，同时MM 可并发肾病综合征、慢性肾功能衰竭、淀粉样心肌病、感染、低蛋白血症和肺栓塞，上述症状均可导致胸腔积液的发生［4］。骨髓瘤细胞直接累及胸膜腔产生的MPE 极为罕见，发生率<1%。本院报道的MPE 发生率高于既往研究，主要原因可能为对所有MM并发胸腔积液可抽液样本均进行传统常规胸水细胞学检查联合FCM检查。

目前，对于MM 并发MPE 的检查主要包括胸腔积液细胞学检查，虽然单纯的病理涂片具有较高的特异性，但其敏感性较低，涂片的染色质量可能会妨碍脱落细胞学诊断［5］。因此，流式细胞术在诊断MM并发MPE过程中发挥较大作用。

意大利国家癌症研究所有数据有力地支持FCM作为一种简单可靠的技术，在胸水样本中可以明确鉴定肿瘤浆细胞，而且明显比细胞学检查更敏感［6］。目前，认为CD138、CD38、CD45、CD19和CD56均是可鉴别良恶性浆细胞的主要免疫表型［7］。本研究运用FCM 检测，均可从6 例患者胸腔积液中找到浆细胞，但胸腔积液脱落细胞学检查均未见癌细胞。所有患者CD38及CD138均为阳性，除病例6之外，所有患者CD19均为阴性。病例4虽然κ和λ均为阳性，但κ/λ>4.0，仍有意义。因此，有必要将FCM纳入胸腔积液的常规检查中，其在鉴别胸腔积液良恶性中发挥重要作用。

Zhong等［8］研究发现，23例MM合并MPE患者，其中男性11 例，女性12 例，中位年龄为56.8（37～68岁），大多数患者为IgA 亚型，其次为IgG 亚型。该研究男性患者多于女性，中位年龄62（49～72）岁，与既往研究相似，IgA型占大多数（50%），IgG型占30%，这可能与IgA 骨髓瘤患者13 号染色体缺失发生率较高有关［9］。但因本研究样本数较少，同时克隆性浆细胞未做分选，6例患者染色体均为正常核型。

MM患者产生MPE往往预示着疾病进展或复发，为疾病进入晚期的表现。先前的报道指出骨髓瘤性积液患者的总生存期（overall survival，OS）明显少于无骨髓瘤性胸腔积液的患者（P=0.002）［2］。Cho 等［10］研究表明，MM 伴MPE 预后较差，MPE 发生后患者中位生存时间（median OS，mOS）为2.8（0.2～15.6）个月，总死亡率为57.9%。Kamble 等［9］研究发现，13 号染色体缺失在MM 伴MPE 患者中出现率较高，这可能解释了MPE 与不良预后之间的关系，约90%浆膜腔浸润的MM 患者在确诊后1年内死亡［11］。在本研究中，6 例患者在随访结束后，4 例死亡，2 例生存，mOS 为7.5（2～36）个月，MPE 出现后的mOS 为6.5（2～17）个月，研究结果与上述研究基本相符。

目前，骨髓瘤性胸腔积液的治疗应以化疗联合胸腔引流为主［9］。胸膜内予以顺铂治疗可以缓解MPE 症状，但对预后无影响［12］。Ye 等［13］报道1 例以骨髓瘤性胸腔积液为首发症状的患者，最初予以Cy⁃BorD（环磷酰胺+硼替佐米+地塞米松）方案化疗。然而，MPE 快速积聚，后来将化疗方案更换为硼替佐米+达雷木单抗+地塞米松方案，1个月内胸腔积液基本消失。也有学者研究发现，IgG-κ 亚型MM 并发MPE 的患者，最初对地塞米松有良好的反应［14］。Zhong 等［8］研究发现，MM 并发MPE 的患者对联合硼替佐米的治疗具有一定反应。硼替佐米为一种新型的蛋白酶体抑制剂，具有明显的抗骨髓瘤活性。然而，硼替佐米可能引起肺损伤，出现肺部并发症，其中包括胸腔积液［15］。因此，这为应用蛋白酶体抑制剂治疗MM并发胸腔积液增加了更多的挑战［16］。

综上所述，本研究认为在胸腔积液常规检查基础上，亟需联合更为敏感的FCM 检查，以便提高MM并发MPE诊断的阳性率，从而更好地判断预后，指导临床个体化治疗。