龟板固本方对肺癌骨髓抑制小鼠骨髓造血微环境的影响

黎壮伟， 张广丽

广东食品药品职业学院，广东 广州 510520

肺癌的发病率居所有恶性肿瘤发病率的首位，化疗是肺癌的主要治疗手段之一，但化疗会引起骨髓抑制等副作用，严重者可导致化疗终止，影响后续的治疗。化疗引起的骨髓造血功能损伤也是影响患者生存质量和治疗效果的重要因素。因此，寻找有效药物来减轻化疗对骨髓抑制，修复化疗对骨髓造血微环境损伤，成为目前研究的重点。龟板固本方在临床上治疗骨髓抑制具有良好的疗效[1，2]，但其机制不详，本研究从骨髓造血微环境损伤修复的角度研究龟板固本方治疗肺癌化疗骨髓损伤的疗效及其机制，为龟板固本方改善骨髓造血功能提供科学依据，探索治疗肺癌化疗致骨髓抑制的有效处方。

1 实验材料

1.1 动物及细胞株 C57BL/6 小鼠购于北京华阜康科技股份有限公司[生产许可证SCXK（京）2019-0008]，重量18 g～22 g，SPF 级。动物分笼饲养，自由摄食饮水，室温（21 ± 2）℃，湿度30%～60%。Lewis 肺癌瘤株购于中国科学院上海生命科学生物化学与细胞生物学研究所。

1.2 药物 龟板固本方由龟板、黄精、桑椹、黄芪、红参等组成，中药饮片从广州致信药业股份有限公司购买，按常规方法水煎取汁浓缩而成，实验用药生药含量为0.8 g/mL。重组人粒细胞刺激因子注射液，规格75 μg/支，杭州九源基因工程有限公司生产，国药准字S10980029。注射用环磷酰胺由江苏盛迪医药有限公司生产，规格0.2 g/瓶，国药准字H32020857。

1.3 主要试剂和仪器 IMDM培养液购自HYCLONE公司，批号：NWB0372；重组小鼠粒单系集落刺激因子购自美国Peprotech 公司，批号：050755-1；重组白细胞介素-3购自美国Peprotech公司，批号：120948；重组人促红细胞生成素购自美国Peprotech 公司，批号：P9BM0042。Napco-5410 CO2培养箱（美国Shelden 公司）；全自动立式电热压力蒸汽灭菌器（YXQ－LS－SⅡ）；UV2101 PC 型紫外分光光度计（尤尼科上海仪器有限公司）。荧光显微镜（Leica Microsystems Ltd，德国），自动血细胞分析仪（日本Sysmex-820）。TPO Elisa 试剂、EPO Elisa 试剂和GM-CSF 试剂均购自南京建成生物工程研究所。

2 实验方法

2.1 动物分组与给药

将60 只Lewis 肺癌小鼠随机分为4 组，空白组、模型组、龟板固本方组、西药组，每组15只。除空白组外，其他3组均进行造模。小鼠造模完成后24 h 开始给药，龟板固本方组每只小鼠按0.4 ml/d 的剂量灌胃给药；空白对照组和模型组给等量生理盐水；西药组皮下注射重组人粒细胞刺激因子注射液5 ng/g，1次/d，连续给药7 d。

2.2 建立Lewis肺癌小鼠化疗致骨髓抑制模型

取对数生长期的Lewis 肺癌细胞，常规离心，制成瘤细胞混悬液，消毒小鼠右前腋，取0.2 ml接种于皮下。待瘤体生长至直径1～1.5 cm 时，处死小鼠，选取生长良好的瘤组织，剪碎、称重，用细胞匀浆器制成匀浆，制备成浓度为1×107/ml 瘤细胞混悬液，每只小鼠右腋下接种0.2 ml（约1～2×106瘤细胞），接种4 d 后，以小鼠右腋下皮下可触及肿瘤块标志造模成功，建立Lewis 肺癌荷瘤小鼠模型。上述Lewis肺癌荷瘤模型小鼠一次性腹腔注射环磷酰胺250 mg/kg（于临用前配制），以外周血细胞（WBC、RBC、PLT）明显低于正常小鼠（均P＜0.05），提示模型复制成功，完成Lewis 肺癌荷瘤小鼠化疗致骨髓抑制模型[3]。

2.3 观察指标

2.3.1 外周血象检测

每组小鼠分别于造模后（0 d）及给药7 d 后（造模后8 d）尾静脉采血，用自动血细胞分析仪进行血常规检测。

2.3.2 骨髓造血微环境检测

小鼠给药7 天后，经颈椎脱臼处死，取股骨，用剪刀剪开股骨两头，露出骨髓腔，然后用消毒过的注射器、4 号针头，吸取2 ml培养液，反复冲洗骨髓腔收集骨髓细胞，全部置离心管内，反复吹打使细胞完全分散，然后离心10 min（1 000 r/min），去上清，加入适量培养液充分混匀，制成骨髓有核细胞悬液，台盼蓝鉴定细胞活性在95%以上。提取骨髓有核细胞悬液，采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ABC-ELISA）检测骨髓有核细胞悬液上清中的红细胞生成素（EPO），血小板生成素（TPO），粒细胞集落刺激因子（G-CSF）含量，具体按试剂盒说明书操作。

2.4 统计学分析

将所得结果建立数据库，采用SPSS17.0 统计软件进行分析，两样本均数比较用t检验，多组均数比较用方差分析，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 龟板固本方对肺癌骨髓抑制小鼠外周血象的影响

在造模后当天（0 d），模型组、龟板固本方组、西药组的小鼠外周血白细胞（WBC）下降，均明显低于空白组，差异有统计学意义（P＜0.01），模型组、龟板固本方组与西药组的小鼠外周血WBC 组间比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），说明造模成功。用药干预7 d后，龟板固本方组的WBC明显高于干预前（0 d）（P＜0.05），也高于模型组且差异有统计学意义（P＜0.05），提示龟板固本方能显著提升骨髓抑制小鼠的外周血白细胞。西药组WBC 明显高于其他三组，差异有统计学意义（P＜0.01），这跟西药组使用粒细胞刺激因子注射液有关，见表1。

表1 龟板固本方对骨髓抑制小鼠外周血白细胞的影响（±s，×109/L）

表1 龟板固本方对骨髓抑制小鼠外周血白细胞的影响（±s，×109/L）

注：造模后0 d，与空白组比较，①P＜0.01；造模后8 d，与模型组比较，②P＜0.05；与西药组比较，③P＜0.01；龟板固本方干预前后比较，④P＜0.05。

造模后8 d 6.54±1.25③2.34±0.78③3.92±0.64②③④17.8±3.95分组空白组模型组龟板固本方西药组例数15 15 15 15造模后0 d 6.84±1.23 2.11±0.86①2.14±0.63①2.30±0.52①

在造模后当天（0 d），模型组、龟板固本方组、西药组的小鼠外周血血小板（PLT）下降，均明显低于空白组，差异有统计学意义（P＜0.01）；模型组、龟板固本方组与西药组的外周血PLT 组间比较，均无统计学意义（P＞0.05），提示造模成功。用药干预7 d后，龟板固本方组的血小板明显高于模型组（P＜0.01），与干预前比较，龟板固本方干预后，小鼠外周血血小板明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01），提示龟板固本方能显著提升骨髓抑制小鼠的外周血血小板，见表2。

表2 龟板固本方对骨髓抑制小鼠外周血血小板的影响（±s，×109/L）

表2 龟板固本方对骨髓抑制小鼠外周血血小板的影响（±s，×109/L）

注：造模后0 d，与空白组比较，①P＜0.01；造模后8 d，与模型组比较，②P＜0.01；龟板固本方干预前后比较，③P＜0.01。

造模后8 d 分组 例数 造模后0 d 653.60±86.71 209.60±41.10 390.13±72.04②③337.40±50.16空白组模型组龟板固本方西药组15 15 15 15 652.53±85.43 252.93±63.97①268.20±56.64①237.47±30.76①

在造模后当天（0 d），模型组、龟板固本方组、西药组的小鼠外周血红细胞（RBC）下降，均明显低于空白组，差异有统计学意义（P＜0.01），模型组、龟板固本方组与西药组的外周血RBC 组间比较，均无统计学意义（P＞0.05），提示造模成功。用药干预7 d后，龟板固本方组的RBC明显高于模型组（P＜0.01）；与干预前比较，龟板固本方干预后，小鼠红细胞升高，差异有统计学意义（P＜0.05），提示龟板固本方能显著提升骨髓抑制小鼠的外周血红细胞，见表3。

表3 龟板固本方对骨髓抑制小鼠外周血红细胞的影响（±s，×1012/L）

表3 龟板固本方对骨髓抑制小鼠外周血红细胞的影响（±s，×1012/L）

注：造模后0 d，与空白组比较，①P＜0.01；造模后8 d，与模型组比较，②P＜0.01；龟板固本方干预前后比较，③P＜0.05。

造模后8 d 9.88±0.99 5.13±0.74 6.35±1.33②③4.98±0.90分组空白组模型组龟板固本方西药组例数15 15 15 15造模后0 d 10.16±1.84 5.72±1.24①5.07±1.23①5.15±2.49①

3.2 龟板固本方对肺癌骨髓造血微环境细胞因子GM-CSF、EPO和TPO的影响

用药干预7 d后，与空白组相比，模型组、龟板固本方组和西药组的GM-CSF 及EPO 含量明显减少（P＜0.01），TPO 明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，龟板固本方能明显提高GM-CSF、EPO及TPO含量（P＜0.01），降低TPO含量（P＜0.01）。

表4 龟板固本方对骨髓抑制小鼠骨髓造血细胞因子G-CSF、EPO和TPO的影响（±s）

表4 龟板固本方对骨髓抑制小鼠骨髓造血细胞因子G-CSF、EPO和TPO的影响（±s）

注：与空白组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.01。

分组空白组模型组龟板固本方西药组TPO 28.60±9.12 159.67±30.32①61.93±14.73①②53.53±6.93①例数15 15 15 15 G-CSF 209.00±29.15 120.73±23.77①144.33±29.72①146.87±44.99①EPO 75.40±8.93 43.53±13.22①62.07±11.98①②47.40±17.59①

4 讨论

机体正常的造血活动依赖于造血干细胞（Hematopoietic Stem Cell，HSC）和支持造血干细胞生长发育的骨髓微环境的相互作用。骨髓微环境是指造血干细胞能维持自身细胞系特征的特殊环境组成的组织区域，是造血干细胞赖以生存，进行自我更新，并能产生大量祖细胞的内环境。它包括微血管系统、基质细胞、细胞外基质和多种细胞因子[4]。骨髓微环境结构和功能的完整性对于造血细胞的自我更新及快速增殖至关重要[5]。造血干细胞能保持自我更新与多向分化增殖能力，与骨髓微环境细胞因子调控分不开。造血微环境是造血干细胞赖于生存的基础，与造血生成调控密切相关。造血干细胞在骨髓微环境各种因素的调控下增殖、分化、发育及成熟。特别是促红细胞生成素（EPO），血小板生成素（TPO）和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）是造血微环境中重要的造血调控细胞因子，参与调控骨髓造血祖细胞的增殖、分化和成熟。EPO 是调节红系生成的主要细胞因子，主要调控红系造血干细胞的增殖、分化和成熟；TPO主要促进巨核系祖细胞增殖，促进巨核细胞增殖与分化成熟，以及血小板的成熟和释放；G-CSF 能选择性和特异性地刺激造血干细胞向中性粒细胞的定向增殖和分化，动员造血干细胞进入外周血，并可加速粒细胞成熟。研究骨髓微环境细胞因子对造血细胞生长及细胞系维持具有重要意义。

中医理论认为，脾为后天之本，是气血生化之源，脾虚则血生化无源；肾为先天之本，藏精主髓生血，肾虚则髓海不足而血不能化。若脾肾亏虚，则气血生成不足。化疗所致的骨髓抑制，可归为中医“虚劳”范畴，其基本病机为脾肾亏虚，精亏髓损。对于化疗所致骨髓抑制的治疗原则以健脾益肾法为主。研究表明，中医健脾补肾法能够改善骨髓造血功能，具有较好的生血作用，能有效调节血清中TPO、EPO、GM-CSF 的表达，从而促进骨髓抑制小鼠造血功能的恢复[6-9]；还能明显改善肺癌化疗者骨髓造血功能，提高外周血白细胞总数、中性粒细胞、红细胞、血红蛋白及血小板等。因此，从健脾补肾，填精益髓的治法入手来研究骨髓抑制的治疗，具有较好的中医药理论基础、临床基础和实验基础的支持。

龟板固本方是本研究课题组治疗肿瘤相关性贫血的有效经验方，主要药物由龟板、黄精、桑椹、黄芪、红参等组成，方中龟板性味甘咸，归肾经，为血肉有情之品，峻补精髓，补肾养阴；黄精性味甘平，归脾肾经，滋肾补脾益气；桑椹子味甘，归肝肾经，滋阴补血，有滋补肝肾及补血之效；黄芪性甘，微温，归脾肺经，补中益气，补气以生血；红参味甘、微苦，性温，能大补元气，益血生津。诸药合用，具有健脾补肾，填精益髓的功效，切中骨髓抑制的中医发病机理。在本课题组临床研究中，利用龟板固本方治疗相关性贫血进行临床观察，研究结果表明，龟板固本方治疗肿瘤相关性贫血，能够提高外周血象中血红蛋白、红细胞计数及红细胞比容，疗效显著（P ＜0.05）[1]。进一步研究结果表明，龟板固本方对肺癌化疗引起的骨髓抑制有较好的拮抗作用，减轻化疗患者外周血象中白细胞、血红蛋白及血小板的下降，与对照组比较有显著性差异（P＜0.05），化疗患者口服龟板固本方治疗后，生存质量卡氏评分明显提高，疗效优于对照组（P＜0.05）[2]。龟板固本方改善肿瘤相关性贫血及拮抗化疗引起的骨髓抑制具有较好的疗效。

采用环磷酰胺腹腔注射是制备小鼠骨髓抑制模型的成熟方法，造模成功后，小鼠外周血细胞下降[3，7，9，10]。本实验结果表明，小鼠骨髓抑制造模后，外周血WBC、RBC 和PLT 均明显下降，与空白对照组比较差异有统计学意义（P ＜0.01），说明造模成功。经过龟板固本方干预7 d后，骨髓抑制小鼠外周血常规的WBC、RBC、PLT 明显升高，与干预前比较，差异有统计学意义（P ＜0.01或P ＜0.05）。与模型组比较，龟板固本方组小鼠外周血常规的WBC、RBC、PLT 明显升高，差异也有统计学意义（P ＜0.01 或P ＜0.05）。进一步研究表明，经过龟板固本方干预后，龟板固本方组骨髓抑制小鼠骨髓微环境促红细胞生成素（EPO）、血小板生成素（TPO）和粒细胞集落刺激因子（G-CSF）含量上升，与模型组比较，差异有统计学意义（P ＜0.01 或P ＜0.05）。这些研究结果说明龟板固本方具有减轻骨髓抑制和促进骨髓造血的功能。龟板固本方治疗肺癌化疗后骨髓抑制的机理除了切合骨髓抑制的中医病机以外，初步认为其机制可能是通过以下途径实现的：龟板固本方通过调控骨髓造血微环境的造血因子，通过提升造血因子的含量，修复骨髓造血微环境损伤，保护造血干细胞的作用，从而促进骨髓造血机能修复，达到提升外周血中三系细胞，减轻化疗药物的副作用。但由于机体造血机制十分复杂，涉及造血干细胞自我扩增、造血微环境、免疫功能和多个造血调控通路等，究竟龟板固本方是否通过其他途径改善骨髓造血功能，仍需进一步深入研究。