纤维素酶降解纤维素的机制及其在畜牧业中的应用

宁俊平，孙玲利，孙如玉，徐莹，张旭阳，张淑芳

（1.汝州市畜牧局，河南 汝州 467500；2.河南农业职业学院；3.广西壮族自治区畜牧研究所）

1 纤维素酶的分子结构及作用特征

1906 年，Seilliere 发现蜗牛的消化液能够水解棉花纤维素并产生葡萄糖，这是人类首次发现纤维素酶；1933年，Grassman等研究了一种真菌的纤维素酶系，分离出两个组分，这是人们首次从真菌中分离出纤维素酶，此后纤维素酶的研究和应用便逐步受到世界各国的普遍关注。

纤维素分解酶是一种多组分的复合酶系，是能够将纤维素降解转化生成葡萄糖的一组酶的总称。纤维素酶主要通过水解作用，使连接葡萄糖分子的β-l，4-糖苷键断裂，最终将纤维素分解成单个的葡萄糖分子。诸多研究普遍表明，纤维素的完全降解至少需要三种酶，根据其催化作用不同，分为：①内切-β-1，4-葡聚糖酶（endo-β-1，4-glucanase，EG）：该酶是纤维素酶系中最重要的酶，由于此酶的活性经常由CMC 作为底物测量，因此也称CMCase、Cx 酶。这类酶主要作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β-l，4-糖苷键，从而将纤维素长链分子截短，产生大量具有还原性末端的小分子纤维素。②外切-β-1，4-葡聚糖酶（exo-β-1，4-glucanase，CBH）：这类酶可从纤维素分子的还原或非还原端切割糖苷键，每作用一次可生成一个纤维二糖分子，但是经过该酶充分作用的微晶纤维素则最终生成纤维糊精和纤维二糖，所以也叫纤维二糖水解酶（简称CBH）或C1 酶。③β-1，4-葡萄糖苷酶（β-1，4-glucosidase，BG）：它能水解纤维二糖生成单个的葡萄糖分子，由于该酶不直接作用于纤维素，可以消除上述两种酶产物对水解反应的抑制作用，因此可快速水解纤维二糖和纤维三糖。这三种酶功能虽不同，但具有互补作用的活性酶组分，三者以接力方式把长链纤维素逐步降解成短链，再降解成二糖结构，最后生成单糖，整个反应过程需要各种酶之间相互配合作用，缺一不可。当然实际的纤维素酶系远不止三种，一些纤维素酶也不仅仅只参与纤维素降解的单个步骤。

2 纤维素酶的催化机制

目前，关于纤维素酶的降解机制普遍接受的是协同作用模型，该酶在降解过程中，首先由CX酶在纤维素聚合物的内部起作用，在纤维素的非结晶部位进行切割产生新的末端，然后再由C1 酶以纤维二糖为单位，从末端进行水解，后由β-1，4-葡萄糖苷酶将纤维二糖水解为葡萄糖，如图1。

图1 纤维素酶系协同降解纤维素的过程

3 纤维素酶活性的测定

3.1 总酶活力的测定方法

纤维素酶是多组分酶，各组分间有协同作用，会形成多种产物和涉及多种反馈控制机理，这就使得酶活力测定方法非常困难，国内外报道过的测定纤维素酶活力的方法很多，其中运用较广泛、有代表性的有以下几种。

3.1.1 滤纸崩溃法

由于滤纸所含纤维素结构与天然纤维素相似，以滤纸为底物测定酶活力更有代表性。通常采用恒温振荡器，将一定规则的滤纸片作为底物浸入装有酶液的试管中，在最佳温度和最佳pH 值条件下微振荡，直至滤纸崩溃。计算滤纸完全崩溃所需的时间，求得酶活力。在此基础上发展的测定滤纸失重情况来测定酶活力，克服了由于测定滤纸的崩溃时间较难确定而造成误差大的问题。在一定温度和最佳pH 值条件下，让酶液与滤纸保温反应一段较长的时间，一般需要两个星期以上，然后将滤纸条水洗、烘干，测量出滤纸前后的质量变化，算出滤纸失重率，求得酶活力。

3.1.2 棉线切断法

将细棉线的一端浸入含有适量酶液的试管中，在一定温度和最佳pH 值条件下微振荡，测定棉线被切断所需的时间，求得酶活力。

3.1.3 分光光度计法

当酶促反应发生，生成的糖类物质与显色剂发生显色反应，用分光光度计在500 nm 左右的波长范围内测定吸光度，换算成还原糖含量，然后计算出酶活力。德国的萃取化学公司率先开发出了用CMC 钠盐作底物，以2-羟基-3，5-二硝基苯甲酸作显色剂的分光光度计法。分光光度计法可大大缩短酶活力测定所需要的时间，而且精确度高，得到了广泛应用。国内外许多科研机构根据自己的研究目的，采用不同的显色剂和底物，又由此衍生出更多的方法。日本受就此启发，开发出了浊度法，用0.03%微晶纤维素（Avicel）在最佳温度和pH 值条件下经过酶液作用后，通过分光光度计来测定溶液浊度的减少来代表酶活力。

3.1.4 粘度测定法

由于发现纤维素酶不仅能液化粘度较大的羧甲基纤维素钠溶液，而且酶活力与溶液的液化程度成正相关，因此可以通过测定CMC 粘度降低推算出酶活力，有旋转粘度计法和工研法两种。

3.1.5 平板法

利用磷酸膨胀纤维素制成均匀的双层平板，纤维素酶能在其上形成清晰的透明圈，利用此法可在平板上对纤维素酶产生菌进行筛选，可以大大提高工作效率。此法广泛应用于产纤维素酶的真菌选育中。

3.2 单一纤维素酶组分活力的测定

近年来国内外通用的和新提出的一些纤维素酶活力测定方法大都是采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）法来测定还原糖的生成量，该法简单、灵敏。

3.2.1 外切葡聚糖酶（CBH）活力测定

Desphande 等以合成的PNPC 为底物，以对硝基苯的生成量用于检测CBH活力，刘洁等人依据CBH、EG 和CB三类组分在棉纤维上吸附和脱吸能力不同设计出了一种简易测定CBH 的方法，日本还采用微晶纤维素为底物水解得还原糖量计算酶活力，同样可得到CBH活力。

3.2.2 内切葡聚糖酶（EG）活力的测定

以无定形纤维素为底物，以还原糖的生成量可表征EG组分活力。Ghose所推荐的测定EG酶活力的方法是：用0.5 mL 2% CMC 于0.05 mol/ L 柠檬酸缓冲溶液中，50 ℃反应30 min，加入的酶液量以能形成0.5 mg 葡萄糖为准，然后DNS法测定糖生成量，然后计算出酶活力。此外，还可以利用测定高分子溶液粘度来导出其聚合度和分子量的方法来表征EG 活力，此法可测得初速度，因而确切反映EG活力，且灵敏度较高。

3.2.3 纤维二糖酶（CB）活力测定

从纤维素酶解机制来看，可以纤维素二糖为底物，经过酶解后测葡萄糖生成量表征纤维二糖酶活力。由于纤维二糖和葡萄糖都具有还原性，通常的定糖方法不能区分，常用人工合成的糖苷化合物，如对硝基酚-β-葡萄糖苷、水杨素等作底物测定产生的对硝基酚或葡萄糖生成量。而各种β-葡萄糖苷组分对糖基和糖苷基专一性的要求有差别，因此得到的结果通称为β-葡萄糖苷酶活，与纤维素二糖酶活有区别。

4 纤维素酶在畜牧业上的应用

纤维素酶作为一种新型饲料添加剂，能将麦秸、稻草、玉米芯等粗饲料转化为糖、菌体蛋白等，从而降低饲料中的粗纤维含量，提高粗饲料营养价值，在畜牧生产中发挥着极大的作用。其功效体现在：①单胃动物如猪、鸡等体内由于缺乏内源性纤维素酶，不能消化纤维素，日粮添加纤维素酶可补充内源酶的不足，改善肠道菌群，提高其对粗纤维的利用率。②纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶协同作用可破坏植物的细胞壁，促使细胞内容物释放，提高养分的消化和非淀粉多糖的利用率。③添加纤维素酶可去除果胶、半纤维素、β-葡聚糖和戊聚糖等抗营养因子造成的吸收障碍，增加内源酶的扩散，并使酶与养分充分接触，促进饲料的良好消化吸收。④可维持小肠绒毛形态完整，促进营养物质的吸收。大量的试验也证明了饲料中添加纤维素酶对猪、鸡、牛、羊、鱼等的饲喂效果十分显著。匈牙利学者在猪饲料中按纤维含量的1%添加纤维素酶可提高猪日增重5%，改善饲料转化效率7.8%。日本研究人员证明鸡日粮中添加0.2%的纤维素酶，可使鸡日增重提高5%～10%。

综上，近年来，对纤维素的应用研究不断深入，尤其筛选高效的纤维素酶降解纤维素已成为研究热点。该文对纤维素酶的结构特性、催化机制、酶活测定方法及应用进行论述，今后可加大对纤维素酶的产酶条件进行优化，并通过数学模型进行定量分析，以确立最佳产酶条件并利于酶系的筛选。