拉曼光谱在食品加工及品质控制中的应用

杨雪凡,张 维,顾欣哲,李文慧,吴金鸿,王正武

(上海交通大学农业与生物学院,上海 200240)

蛋白质、碳水化合物、脂质等基本营养物质构成了食品原料的主要成分,食品加工过程会导致食品组分的变化(降解、合成与外源性迁入等)和结构变化(如分子链,由分子内和分子间相互作用导致的聚集态等),直接影响食品的品质和安全性[1]。食品组分构成的复杂性、加工过程中易变性和外源性接触等特点,导致了加工食品的品质难以准确的调控。因此,快速和准确检测方法的建立对食品工业发展具有重要的意义。

传统的检测方法,如分光光度计法、液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱和生物检测技术等,存在着前处理复杂、检测周期长、结构信息有限且不能进行无损检测等特点,依赖传统的检测方法难以实现食品加工的过程控制[2]。拉曼光谱技术不仅能有效克服这些缺点,且在食品成分定量和结构信息等方面具有较大的优势,在食品工业中极具应用前景。近年来,拉曼光谱技术在食品加工过程中的应用研究稳步增加,拉曼光谱与化学计量、成像技术等方法结合的应用研究逐年涌现。本文拟对拉曼光谱技术在不同食品组分监测中的应用进行综述,阐述其应用于食品加工过程中的重要前景和价值,为拉曼光谱在食品加工过程中食品品质的数字化监控提供理论依据。

1 拉曼光谱简介

拉曼光谱(Raman spectra)是由印度科学家C.V.拉曼(Raman)发现的散射光谱,即当光子照射到样品的分子中,发生非弹性碰撞,散色光子的频率和方向同时发生改变的现象[3]。在拉曼散射过程中存在着斯托克散射和反斯托克散射。光子与分子内部电子碰撞发生能级交换后,分子实现能级跃迁进入激发态,光子以更低的频率散射出去,即斯托克散射。当分子从激发态离开时,以较低的频率发生的散射,成为反斯托克散射。基于斯托克散射频率总是远大于反斯托克散射,拉曼光谱检测技术中,主要检测斯托克散射(如图1所示)[4]。拉曼位移是拉曼光谱的主要指标,即拉曼散射与弹性散射(散色频率不变,方向改变)频率的差值[5]。拉曼位移主要与被检测物体的分子内部振动、旋转等有关,因此可用直观反映分子的化学键、官能团等结构信息。

图1 拉曼散射能级图

常规的拉曼光谱信号较弱且容易受到荧光的干扰。傅里叶变换信号累计和通过吸附金、银等增强信号技术的出现,有效地提高拉曼光谱的灵敏度,扩展了拉曼光谱的应用。根据技术特点,拉曼光谱又可分为傅里叶变换拉曼光谱(FT-Raman)、近红外傅里叶变换拉曼光谱(NIR FT-Raman)、表面增强拉曼光谱(SERS)和显微拉曼光谱(V-MRS)[6]。同时由于水的拉曼散射较弱,可以作为样品的有效溶剂,为拉曼光谱在食品检测中应用打下了基础。

2 拉曼光谱在食品组分检测中的应用

2.1 蛋白质

蛋白质中的许多官能团都有其独特的拉曼光谱信号,拉曼光谱实现有效表征的蛋白结构信息如表1所示[7]。

表1 蛋白质拉曼光谱信息分配

拉曼光谱能有效地表征蛋白多肽链的骨架结构、侧链微环境等,从而获取蛋白质的空间结构信息。二级结构信息是蛋白质研究的焦点之一,酰胺Ⅰ和Ⅲ带常用于表征蛋白质的α-螺旋、β-折叠、转角和无规卷曲等骨架构象变化,其在拉曼光谱中有较强的信号。然而,酰胺Ⅲ区由于β-折叠的特征带(1230～1245 cm-1)和无规则卷曲的特征带(1240～1255 cm-1)产生重叠,因此1225～1350 cm-1产生的谱带较复杂[8-9]。食品加工过程中蛋白质的变性对食品的营养价值有重要的作用,拉曼光谱可以直接反映蛋白的结构信息,为研究加工导致的蛋白变性机理提供有效的技术手段。Nawrocka等[10]利用拉曼光谱观察烘焙制品中加入膳食纤维对面筋蛋白二级结构(酰胺Ⅰ带)的变化,发现烘焙会引起α-螺旋含量降低、β-折叠含量增高,蛋白异常折叠和聚集,蛋白质变性,从而影响烘焙制品的质量。此外,通过拉曼观察的蛋白质二级结构变化也可以表征肉品在加工储藏过程中的品质变化,目前已有利用拉曼光谱数据来构建猪肉感官评价指标模型[19],与传统方法相比,拉曼光谱不仅可以提供蛋白质二级结构信息,还提供脂质、水等其他营养素信息,更为全面地提供了肉品质量信息。

氨基酸残基的特征谱带也被用于获取有关微环境和构象变化信息。蛋白中的酪氨酸双峰带、色氨酸带可用于监测微环境极性。热处理可以使大豆11S球蛋白表面疏水性的增加,减少聚集度,暴露出活性基团,齐宝坤等[13]用拉曼光谱发现11S球蛋白的主链去折叠化、去螺旋化,侧链酪氨酸和色氨酸残基暴露程度增加,同时,使二硫键的g-g-g构型变为t-g-t构型,使其疏水性增高。拉曼光谱也可用于检测食品加工过程中蛋白质与其他食品基质之间的反应。肉糜在加热过程中肌球蛋白、肌浆蛋白的变性凝固是形成凝胶的主要原因[11]。Yang等[11]用拉曼光谱量化肉凝胶二级结构变化,氢键、二硫键、疏水基团的暴露重排导致三维凝胶无法承载游离水和脂肪,解释了凝胶形成过程中水和脂肪迁移机制。

拉曼光谱也是用于研究蛋白质性能与结构之间关系的重要手段。通过对蛋白质进行改性,调节蛋白质的性能,如乳化性、起泡性、凝胶性、溶解度和抗氧化活性等,对食品的品质有重要的意义[14-15]。Qiu等[16]发现麦醇溶蛋白脱酰胺后,表征羧基C=O伸缩振动的1780 cm-1峰强度增加,并利用该波段构建标准曲线定量脱酰胺度。Wong等[7]发现在大豆分离蛋白、乳清蛋白脱酰胺过程中,酰胺Ⅰ、Ⅲ带的拉曼光谱强度逐渐增加,表明其去折叠程度增加,分子趋于无序,变性程度增加,从而提高了大豆蛋白和乳清蛋白的溶解性等。

蛋白质的结构变化与食品品质之间的关系一直是研究的热点,对蛋白类食品加工具有重要的指导意义。拉曼光谱能够获取较为全面的蛋白质原位结构信息,主要为二级结构信息,为监测加工储藏过程中的食品品质变化创造了可能性。然而,由于食品组分的复杂性,拉曼光谱通常能获取较大而复杂的数据,也易受到其他组分信息的干扰,因此需要结合统计学方法进一步提取典型的结构信息,保证数据的有效性。同时,对食品工业中典型的蛋白质参与的而引起食品品质变化的化学反应(如美拉德反应、蛋白凝固等)产生的拉曼光谱信息仍有待于进一步挖掘。

2.2 碳水化合物

用于快速表征碳水化合物结构特征的传统红外吸收光谱易受到水分子信号干扰,同时谱带较宽导致分辨率低。拉曼光谱能够克服这些缺点,且对碳水化合物中骨架结构C-C对称伸缩、吡喃环振动较为敏感,而红外光谱则对α-1,4糖苷键的骨架振动响应较高[24-27]。因此,在碳水化合物的结构表征中,拉曼光谱和红外光谱技术通常互为补充。Kizil等[28]结合FT-IR和FT-Raman成功快速检测辐照加工对淀粉结构的影响,并通过统计模型对辐照淀粉进行了分类,因此开发振动光谱联合检测设备更有利于检测。

目前,拉曼光谱用于表征碳水化合物的结构的研究主要集中于淀粉。在475～485 cm-1处的强谱带区是淀粉的吡喃环骨架振动区域,被认为是葡萄糖聚合链,478 cm-1处的强带可表征多糖聚合度[20];478～577 cm-1的光谱范围涉及C-C及C-O扭转模式。800～1500 cm-1的拉曼谱带为淀粉的指纹区,表征C原子与C、H、O原子共价键的不同振动模式[25]。2800～3000 cm-1区域为C-H拉伸振动,该范围拉曼强度高,但由于很多有机物均有此特征,因此不能作为区分化合物的依据[26]。淀粉的具体拉曼光谱信息如表2所示。

表2 淀粉拉曼光谱谱带分配

拉曼光谱已应用于食品加工对于淀粉的影响,改性淀粉是其中之一。由于组成不均一,天然的淀粉通常存在理化性质不稳定的缺陷,需要加以化学改性用于增强黏度、延长/缩短凝胶化时间、增加稳定性等,扩展其商业化应用范围。取代基团、取代度、聚合度是淀粉改性的重要指标,但常用的检测方法为湿化学方法,取样量大、操作复杂且易损伤样品。拉曼光谱检测的便捷和及时性,为确定改性的程度和官能团添加顺序提供了技术支撑,有助于理解淀粉化学改性的反应模式及设计。例如,淀粉通过辛烯基琥珀酸酐(OSA)酯化形成具备两亲性的辛烯基琥珀酰淀粉(OS-淀粉),可用作乳化剂、密封剂和脂肪替代剂等,并在食品工业中广泛应用,目前FT-IR常被用于比较OS-淀粉与天然淀粉的差别,并表征改性程度[36],而拉曼光谱较红外光谱具有更高的空间分辨率,Sun等[37]用拉曼光谱测定了单淀粉颗粒中辛烯基琥珀酸基团(OS)的分布,其在1670 cm-1处的特征峰表征OS中的羰基与淀粉分子结合,并通过羰基(1679 cm-1)与ν(C-H)(2910 cm-1)的面积比获得了OS空间分布信息及取代水平。

淀粉的糊化和老化是食品加工和储藏中的重要特性。糊化是水分子和淀粉分子间和分子内的氢键重排导致的,糊化后淀粉更加适口且有利于消化吸收。淀粉吸水重新形成的氢键直观表现为O-H键(3212、1633 cm-1)强度增加[30,38]。淀粉糊化伴随着晶态消失,拉曼信号与淀粉结晶度间存在线性相关性,特别是480 cm-1的半峰全宽可用于表征淀粉晶体的短程有序结构,值越小,短程分子量越大,是检测淀粉糊化过程短程有序结构破坏情况的重要依据[35,37]。随外界条件变化,糊化淀粉无序分子链又会重新组装形成有序结构导致老化,不仅影响口感也降低消化率。老化也伴随着晶体相变化,Wang等[32]利用拉曼对淀粉晶体短程序敏感特点研究了低含水量下淀粉回生的结构变化。老化影响着淀粉类食品的储藏期和接受度,Hu等[24]结合中红外和拉曼光谱开发了一种淀粉回生度测定的方法,可应用于货架期实际预测中。

此外,淀粉的结晶与非晶性都影响其本身的理化性质以及反应过程(组成结构、天然合成、糊化过程、反应活性),直接决定了淀粉的应用性能及产品质量,而淀粉的结晶度极易受到加工环节(如水分含量变化、酸解、研磨、微波等)的影响[39]。拉曼光谱可提供分子的晶体组成和取向信息,目前已运用于各种材料的分子成像中[40-42]。Galvis等[43]以高直链淀粉为参照模型,基于糖苷键在865 cm-1的各向异性(偏振度),通过偏振拉曼光谱(PRS)绘制了洋兰淀粉颗粒结晶取向图;Mutungi等[30]利用FT-拉曼光谱获得的木薯淀粉480 cm-1骨架区积分面积与其结晶度与有好的线性相关性(R2=0.990),因此,拉曼光谱在实际应用中可以作为快速检测淀粉结晶度的有效工具,也有助于理解淀粉表观特性与晶体结构关系。

2.3 脂质

目前在食品科学中,拉曼光谱主要应用于纯油脂性质的检测中。脂质在加工与储藏过程中,水解产生的游离脂肪酸是食品风味物质的重要前体,同时氧化和酶解产生的脂肪酸、醛、酮等有害成分也会导致酸败,因此脂肪酸组成、酸价、过氧化值是脂质品质评价的主要指标,拉曼光谱对于双键结构的灵敏度极高,可广泛应用于评价脂质的品质。不饱和脂肪酸的ν(C=C)和饱和脂肪酸的δ(CH2)分别在1658和1443 cm-1附近出现特征拉曼谱带,且ν(C=C)拉曼谱带会受到共轭及顺反构象的影响出现30～50 cm-1的偏移,拉曼光谱得以成功用于以动植物油为主要原料的食品的饱和度和掺假鉴定上[44-45],脂质的拉曼光谱学特性信息如表3所示。碘值被用来评估脂质的过氧化程度。Dymińska等[46]以13种植物油为原料,通过脂质中ν(C=C)和ν(CH2)的红外光谱和拉曼光谱积分强度成功构建了光谱信息与碘值的线性关系:Iν(C=C)/Iν(CH2)=7.449×10-4×碘值-0.0339(r=0.988)和Iν(C=C)/Iν(CH2)=9.299×10-4×碘值-0.023(r=0.976),Zając等[47]也通过该关系测定了马脂肪组织切面的碘,并由此研究了脂肪层深度与碘值大小的关系。靳昙昙[48]用拉曼光谱结合化学计量法对食用调和油的酸价及过氧化值进行测定,并成功测定了77份花生油、菜籽油、芝麻油三种植物油(体积比在0～100%梯度)调和的食用调和油中的组分及其比例。

表3 食用油脂拉曼光谱分配

植物油常用作油炸,拉曼光谱能评估其在高温下氧化稳定性。Carmona等[49]研究了190 ℃下加热2～5 h的四种橄榄油的氧化稳定性,2995～3040 cm-1区域特征峰与双键相关,其拉曼强度随加热时间增长降低。反式脂肪酸也会降低油脂营养价值,氢化或精炼都会导致反式脂肪酸的出现,高温加热也会生成少量反式脂肪酸[50]。Gong等[51]利用逐步多元线性回归和偏最小二乘法建立模型成功预测食用油热诱导产生的反式脂肪酸。

由于脂质的拉曼特征峰特殊性不强,导致其在复杂体系中的检测更易受到其他组分干扰,因此需要借助统计学方法或脂质降解产生的脂肪酸等中间产物进行判断。目前,除了纯食用油,拉曼光谱也用于蛋白质和水含量较高的肉品体系中脂肪酸检测,结合统计学方法能综合性表述肉品品质[47,18-19]。

2.4 类胡萝卜素

类胡萝卜素是一类类异戊烯聚合物,多双键结构赋予了其高抗氧化活性,对慢性疾病有很好的疗效[54-55]。目前主要有两种方法监测类胡萝卜素:色谱法和光谱法,色谱常用反向HPLC,前处理复杂且易造成损失,通常需要25 min才能获得番茄红素及其异构体的清晰峰形[56],而光谱的使用避免了这些缺陷。类胡萝卜素在拉曼光谱中的三个特征谱带为ν1(C=C)、ν2(C-C)、δ(C-CH3),可用于类胡萝卜素的鉴定。Oliveira等[57]研究了50种植物样品及其标准提取物中的天然胡萝卜素的特征谱带,发现由于类胡萝卜的不同类型、不同存在基质会导致拉曼波数出现较大偏移,ν1(C=C)范围为1511～1531 cm-1,ν2(C-C)范围为1151～1172 cm-1,δ(C-CH3)范围为1000～1014 cm-1,特别是ν1会受类胡萝卜素种类影响,C=C双键数目增加,波数减小,另外两个特征带影响因素较为复杂不仅与基质有关也与类胡萝卜素构象有关[54-58]。Osterrothová等[59]用拉曼光谱测定不同雪藻样品中主要类胡萝卜素并确定类型,发现ν1(C=C)频移与样品中不同类胡萝卜素的比例有关,有助于不同类胡萝卜素鉴定。此外,类胡萝卜素的含量和异构化状态直接决定了食品的品质和营养,而加工过程对其含量和异构化均有显著影响[60],目前已有拉曼测定食品体系中类胡萝卜素含量及异构化程度的研究,Portarena等[61]也依据ν1(C=C)和ν2(C-C)之间的强度比(I1523/I1156)评估了橄榄油中β胡萝卜素和叶黄素的相对丰度。Hikima等[62]用拉曼光谱定量检测鲑鱼中的虾青素(1518 cm-1),利用拉曼光谱分辨不同品质的鲑鱼肉比视觉测定方法更精确。Schulz等[58]用拉曼光谱表征了胭脂树籽中的特殊类胡萝卜素Bixin的顺反异构体。

食品是复杂有机基质,大多数情况下样品中ν1(C=C)频带是一组重叠的频带,这归因于混合类胡萝卜素信号杂糅,结构类似的类胡萝卜素在拉曼光谱中仅表现出略微的谱带偏移,因此,拉曼光谱在未知体系中区分不同的类胡萝卜素的能力有限。

2.5 其他组分

在食品其他组分方面拉曼光谱应用较少,如微量元素及维他命,Martha等[63]对牛奶中加入的游离钙离子对牛奶中磷酸钙胶束稳定性的影响进行了研究,实现了对牛奶中的钙离子定量分析。Radu等[64]利用SERS检测了谷物中的维生素B族。虽然拉曼光谱灵敏度高可测量痕量物质,但存在检测成本高(SERS活性基底种类少,价格高)、易受荧光干扰等缺点,因此,食品全组分检测仍需要拉曼光谱技术的进一步研究开发。

3 拉曼光谱结合统计学方法在食品加工中的应用

拉曼分辨率小于0.5 μm,可提供样品原位结构及化学信息[65],但由于食品体系和食品加工过程对食品体系影响的复杂性,官能团及结构最直接的光谱信息会受到干扰,出现非线性基线偏移、斜率变化引起的与研究对象非相关的响应等,拉曼光谱需要借助于数学统计的方法进行信息处理,以确保光谱信息的准确性。傅立叶变换、多项式拟合,标准正态变量(SNV)、乘法信号校正(MSC)、正交信号校正(OSC)和间隙细分二阶导数(GSSD)和小波变换均已应用于对分析前的代表性光谱区域进行处理[66];为避免基线效应,非对称最小二乘法、多项式拟合等方法已广泛用于原始拉曼数据的基线漂移和荧光校正[65]。

对于多组分的食品体系,可能出现光谱学特征峰带的重叠,则需要通过多变量的分类量化分析方法建立数学模型来加以解决,常用的如软独立建模技术SIMCA、主成分分析PCA、偏最小二乘回归PLS、最小二乘差别分析PLS-DA、支持向量机技术SVM、交替最小二乘法MCR-ALS等[67]。对于检测食品中的营养素,Mazurek等[21]基于PLS处理了市售的21种液态牛乳的FT-Raman光谱数据,获取了其脂肪、蛋白质、碳水化合物和干物质的定量信息,误差仅3.4%～5.6%。对于加工中食品原料的变化,Hu等[24]利用拉曼光谱结合中红外光谱监测淀粉回生度,通过偏最小二乘(PLS)、区间PLS(iPLS)、协同区间PLS(siPLS)和向后区间PLS(biPLS)对MIR和拉曼光谱数据进行处理并提取两种不同水平的融合数据,通过中级融合方法构建的PLS模型获得了最满意的性能,成功测定淀粉的回生度,相关系数为0.9658。对于加工掺假,Qin等[68]用基于自适应迭代重加权惩罚最小二乘法去除奶粉的荧光信号,采用简单阈值法对三聚氰胺(673 cm-1)和尿素(1009 cm-1)的单波段荧光校正图像进行分类,检测限为50 mg/mL。Nedeljkovic等[69]运用PCA-DA成功区分了乳脂与掺入向日葵油、椰子油和棕榈油的乳脂类似物(灵敏度100%)。Dong等[70]用最小二乘支持向量机Bay-LS-SVM改进数据处理方式,与PLS比获得更高的精度和计算效率(R2=0.9996)。

此外,感官属性也是食品品质的重要指标,拉曼建模亦被成功应用于预测食品的感官特性和基于感官属性的质量分级。蛋白质疏水性、胶原蛋白溶解及脂肪酸浓度决定了肉的感官指标:多汁性和嫩度,Fowler等[18]利用拉曼光谱获得的蛋白质结构信息与消费者感官数据建立多元线性回归模型,成功预测多汁性和嫩度,预测值和观测值间的相关性达到0.42～0.47。Wang等[19]也通过PLS成功建立了猪腰肉多汁性、嫩度、咀嚼性三个感官属性与拉曼信号的预测模型,准确度达80%以上,并用SVM根据嫩度和咀嚼性将猪腰肉的感官评价及对应拉曼数据分为三个等级,预测等级为好的猪肉准确率达100%。

此外,近年来拉曼成像技术不断发展,拉曼成像需要大量光谱信息,此时普通的单变量分析方法局限性大,更需要选用适当的化学计量法进行数据处理,Qin等[71]利用空间偏移拉曼光谱结合混合自建模分析SMA方法,获得了番茄红素在不同成熟度番茄中的可视化分布图。

拉曼光谱的缺点在于其在对复杂体系研究时,产生的信息糅杂及生物分子的高度干扰、激光产热以及其拉曼散射本身强度弱。因此引入高效的算法、快速的图像处理软件和硬件以及降低设备成本是未来研究的方向,从而能够将实验室结果尽早转化为工业应用。同时,将当前的光谱技术与其他感应设备(如电子舌、电子鼻等)集成在一起,可以提高光谱和光谱成像方法的预测准确性,并扩大其应用范围。

4 总结和展望

拉曼光谱技术因其方便快捷和分辨率高的优势在食品加工中品质检测的应用迅速扩大,然而要进一步深入探究食品加工过程中品质的变化规律和机制,为食品精细加工技术和工业化生产应用提供理论指导,拉曼光谱技术的发展在以下三个方面有待进一步的加强:a.拉曼光谱、组分结构与食品品质三者之间的相关性数据有待进一步的完善。b.与其他检测技术,如偏振光、红外等结合的拉曼光谱技术有待进一步的开发,以提高复杂食品体系的检测的准确性。c.以食品的品质指标为样本,以拉曼数据为基础,结合统计学方法,建立模型和图像处理,进一步开发便携式拉曼检测设备。