无柄灵芝提取物中营养成分及体外抗氧化活性分析

钟千贵,陈天赐,邱铭锰,刘新锐,李 莹,江玉姬,,陈炳智,,*

(1.福建农林大学食品科学学院,福建福州 350002;2.福建农林大学菌物研究中心,福建福州 350002)

灵芝(Ganodermalucidum(Curtis)P. Karst)民间称灵芝草,是一种名贵的中药材,性温,气味苦平无毒。常服用灵芝有滋补强身、扶正固体、延年益寿等功效[1]。现代药理学表明灵芝能产生免疫调节作用,能诱导细胞因子的产生,具有抗肿瘤[2]、抗炎症[3]、抗病虫侵入、抗氧化、抗糖尿病的能力,结合临床实验的证明,发现灵芝对各种疾病有显著的预防和治疗效果[4-7]。由于灵芝具有独特的药理作用和基本无副作用的特点,其中赤芝和紫芝被列到中国药典中,在国际上也传有盛誉[8]。作为灵芝属的一个种,无柄灵芝GanodermaresinaceumBoud.又名圆孔灵芝、扁灵芝、树芝、三秀灵芝等,与赤芝一样,长期被用于预防和治疗各类疾病[9]。已有研究记载无柄灵芝的提取物具有重要的抑菌活性[10],以及明显的抗癌、增强免疫力和保肝护肝等多种药理作用[11]。

目前对赤芝的研究比较广泛、深入,不论是其含有的物质结构[12-14],活性成分还是功能作用[15-18]。然而关于无柄灵芝的研究报道相对较少,主要集中于栽培育种、无柄灵芝的分类[19-21]、三萜、杂萜生物碱等化学成分结构分析、抗菌作用等。刘莉莹等[22]从无柄紫灵芝的乙醇提取物的氯仿部分分离鉴定了8个三萜和1个生物碱化合物,但并未对其功能进行研究。杨桥芬[23]利用正、反相层析等技术分离纯化了无柄灵芝的化学成分,分离到32个化合物,其中2个为新化合物,但未对其进行深入的功能研究。本课题组Chen等在中国赤芝主产区分离鉴定到了3株无柄灵芝,并发现无柄灵芝子实体内三萜含量较赤芝高[24]。因此,本研究进一步以无柄灵芝为对象,赤芝为参考,对比分析了无柄灵芝提取物中的营养物质及体外抗氧化能力,为下一步无柄灵芝的功能性研究以及综合开发利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

试验所用的赤芝、无柄灵芝子实体 福建农林大学菌物研究中心提供;无水乙醇、苯酚、葡萄糖、浓硫酸、甲醇、冰乙酸、香草醛、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、过硫酸钾 上海麦克林生化科技有限公司;三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、邻苯三酚、硫酸亚铁、双氧水、水杨酸、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、氨基酸标准品 日本和光纯药工业公司;柠檬酸锂(四水)、氯化锂柠檬酸(一水)、硫代双乙醇、聚氧乙烯月桂醚、辛酸 南京化学试剂股份有限公司。

UV-2600型紫外分光光度计 岛津仪器(苏州)有限公司;SCIENTZ-12N型冷冻干燥机 宁波新芝冻干设备股份有限公司;HH-2型数显恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;H-1850R型高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限司;R205型旋转蒸发仪旋转蒸发器 上海申生科技有限公司;FZ102型中药粉碎机 昆山市超声仪器有限公司;L-8900型氨基酸自动分析仪 天美(中国)科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 提取物制备

1.2.1.1 灵芝水提物制备 赤芝、无柄灵芝子实体经70 ℃烘干、粉碎过60目筛后置于烧杯,按料液比1∶15 g/mL,加入超纯水于90 ℃水浴2 h、15 kHz超声0.5 h、11 μm滤纸0.1 MPa抽滤后得到第一次滤液。按同等料液比往第一次滤渣中加入超纯水重复水浴、超声、减压过滤收集第二次滤液。重复第二次步骤收集第三次滤液。最后将三次收集的滤液经旋转蒸发浓缩后置于冷冻干燥机中干燥24 h备用。

1.2.1.2 灵芝醇提物制备 参照Guo等[25]的方法,步骤与水提物相似,把超纯水换成55%的乙醇溶液按料液比1∶30 g/mL配制,60 ℃水浴2 h、15 kHz超声0.5 h、11 μm滤纸0.1 MPa抽滤后得到第一次滤液。按同等料液比往第一次滤渣中加入55%的乙醇溶液重复水浴、超声、减压过滤收集第二次滤液。重复第二次步骤收集第三次滤液。最后将三次收集的滤液经旋转蒸发浓缩后置于冷冻干燥机中干燥24 h备用。

1.2.2 总糖含量测定 采用苯酚-硫酸法测定总糖含量[26],以葡萄糖作为标准品,测得标准线性回归方程为:y=8.78x-0.0322,决定系数R2=0.9992。

1.2.3 总三萜含量测定 采用香草醛-冰醋酸法测定提取物中总三萜物质含量[27],以齐墩果酸为标准品,测得标准线性回归方程为:y=9.855x+0.0195,决定系数R2=0.9938。

1.2.4 游离氨基酸含量测定 参照Lu等[28]的方法,经过前期预实验及后期实验需求将1.2.1所得样品分别与超纯水配制成3 g/L的溶液,然后过0.22 μm的滤膜。测定参数:分离柱温度57 ℃,检测波长570 nm(脯氨酸检测波长为440 nm);进样量20 μL;缓冲液流速0.35 mL/min;反应液茚三酮试剂,其流速为0.35 mL/min,单元温度135 ℃,离子交换树脂(4.6 mm×100 mm,粒径7 μm),柱温为57 ℃,反应器在115 ℃,进样速度为250 μL/min。缓冲液的配制:蒸馏水700 mL、柠檬酸锂(四水)5.73 g、氯化锂1.24 g、柠檬酸(一水)19.90 g、硫代双乙醇5.0 mL、聚氧乙烯月桂醚4.0 mL、辛酸0.1 mL。

1.2.5 体外抗氧化活性测定

1.2.5.1 ABTS阳离子自由基(ABTS+·)清除能力的测定 参照Li等[29]的方法稍作改动。首先将1.2.1中所获得的样品与蒸馏水制备成500 mg/L的溶液备用;分别取0.2 mL的7.4 mmol/L ABTS溶液及2.6 mmol/L过硫酸钾溶液,充分混匀,避光静置12 h,即得ABTS+·母液。将ABTS+·母液用95%乙醇稀释,使其在734 nm处的吸光值变为0.700±0.020,静置30 min后,即得ABTS+·工作液。分别吸取10 μL不同的灵芝样品溶液加入190 ABTS+·工作液,振摇10 s以充分混匀后静置6 min,于734 nm处测定吸光值。根据下列公式计算ABTS阳离子自由基的清除率:

ABTS阳离子自由基清除率(%)=[1-(AX-AX0)/A0]×100

式中:AX为样品与ABTS阳离子自由基反应的吸光值;AX0为蒸馏水代替ABTS阳离子自由基的吸光值;A0为蒸馏水代替样品的吸光值。

1.2.5.2 DPPH自由基清除能力的测定 参照Morales等[30]的方法并略作修改。首先取与1.2.5.1中相同浓度的不同样品溶液1 mL与DPPH 溶液(0.1 mmol/L,95%乙醇配制)1 mL充分混匀,室温避光静置30 min,517 nm测定吸光值;用1 mL 95%乙醇溶液代替DPPH溶液为样品参比组;空白组为1 mL DPPH溶液与1 mL 95%乙醇溶液。DPPH自由基清除活力根据下式进行计算:

DPPH自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

式中:Ai为样品组吸光值;Aj为样品参比组吸光值;A0为空白组吸光值。

1.2.5.3 羟基自由基清除能力的测定 参照王爽等[31]方法进行,取与1.2.5.1中相同浓度的不同样品溶液备用,反应体系如下:FeSO4(9 mmol/L)、水杨酸-乙醇溶液(9 mmol/L)、样液及H2O2溶液各1 mL,于37 ℃反应30 min,于510 nm处测定吸光值。

羟基自由基清除率(%)=[1-(Ax-AX0)/A0]×100

式中:Ax为样品的吸光值;Ax0为蒸馏水代替H2O2的吸光值;A0为蒸馏水代替样品的吸光度值。

1.3 数据处理

本研究的实验数据统计分析采用SPSS 17.0,用Originpro 8.0、Excel 2010进行做图。

2 结果与分析

2.1 总糖含量测定结果

对2种灵芝进行提取制备,赤芝和无柄灵芝水提物的提取率分别为7.73%和8.12%,醇提物的提取率分别为9.21%和9.83%,这与刘艳芳等[32]报道的提取率相似。然后对两种灵芝不同提取方法所获得提取物中的总糖含量进行检测,结果见图1所示,可以看到赤芝水提物与无柄灵芝水提物中总糖含量均高于各自醇提物,分别为51.54%、48.77%。两种灵芝水提物总糖含量没有显著性差异(P>0.05),醇提物总糖含量存在显著性差异(P<0.05)。无柄灵芝醇提物中总糖含量最低,为22.88%。总糖含量从高到低依次为赤芝水提物>无柄灵芝水提物>赤灵芝醇提物>无柄灵芝醇提物。其中,赤芝的提取物的总糖含量比无柄灵芝的提取物高,与Chen等[24]比较无柄灵芝与赤芝子实体多糖含量的结果相吻合。

图1 两种灵芝不同提取物中总糖含量

2.2 总三萜含量测定结果

两种灵芝不同提取方法所获得提取物中灵芝三萜含量如图2，可以看到无柄灵芝醇提物总三萜含量最高为25.37 mg/g,无柄灵芝水提物最低为1.3 mg/g,呈显著差异(P<0.05)。赤灵芝与无柄灵芝的醇提物三萜含量均高于各自水提物,且具有显著性差异(P<0.05)。这与报道的结果相似,通常灵芝三萜类化合物属醇溶性成分,醇提取物的三萜含量一般较水提取物高[33]。本研究数据显示总三萜含量由高到低依次为无柄灵芝醇提物>赤灵芝醇提取物>赤灵芝水提物>无柄灵芝水提物。其中无柄灵芝提取物的总三萜含量比赤芝提取物高,这与Chen等[24]检测比较无柄灵芝与赤芝子实体的三萜含量的结果相吻合。

图2 两种灵芝不同提取物中总三萜含量

2.3 游离氨基酸含量测定结果

两种灵芝不同提取物中游离氨基酸含量如表1,可以看到无柄灵芝提取物中检测出的缬氨酸、亮氨酸、酪氨酸、精氨酸4种氨基酸在赤芝提取物中均未检测出,除此之外苏氨酸、谷氨酸、丙氨酸、赖氨酸在无柄灵芝提取物中的含量相对较高。无柄灵芝水提物与醇提物的游离氨基酸总量分别为105.224和61.144 mg/g,具有显著性差异(P<0.05)。而赤芝水提物与醇提物中的游离氨基酸总量分别为11.177和8.295 mg/g,具有显著性差异(P<0.05)。赤芝(醇提物与水提物)与无柄灵芝(醇提物与水提物)提取物中必需氨基酸占游离氨基酸总量比(E/T)分别为29.795%±1.091%和39.173%±4.108%,可以看出无柄灵芝中必需氨基酸占比要高于赤芝。其中无柄灵芝提取物的组氨酸含量也显著高于赤芝提取物(P<0.05),相比刘伟等[34]报道的2种无孢灵芝(鹿角灵芝和龙芝2号)均不含组氨酸,无柄灵芝提取物的游离氨基酸组成具有特异性。

表1 不同灵芝不同提取物中游离氨基酸含量

2.4 提取物体外抗氧化活性分析

四种灵芝提取物对ABTS阳离子自由基清除率如图3A。无柄灵芝醇提物对ABTS阳离子自由基的清除能力最强,为54.48%。在同一品种不同提取方法的情况下,醇提物的清除能力大于水提物,存在显著差异(P<0.05)。在不同品种同一提取方法的情况下,无柄灵芝醇提物的清除能力和赤芝的醇提物具有显著差异性(P<0.05),无柄灵芝水提物和赤芝的水提物没有显著差异(P>0.05)。从总体上来看,赤芝和无柄灵芝的ABTS阳离子自由基清除能力,差异不显著(P>0.05),与赤芝相比,无柄灵芝对清除ABTS阳离子自由基的效果更好。

四种灵芝提取物对DPPH自由基清除率如图3B。四种提取物都具有一定的清除DPPH自由基能力,其中无柄灵芝醇提物最强。在同一提取方法不同品种的情况下,无柄灵芝的醇提物和赤芝醇提物的清除能力存在显著差异(P<0.05),无柄灵芝的水提物和赤芝水提物之间的清除能力无显著差异(P>0.05);在不同提取方法同一品种的情况下,赤芝的醇提物和水提物的清除能力存在显著差异(P<0.05),醇提物的清除能力大于水提物,无柄灵芝的醇提物和水提物具有显著差异(P<0.05),无柄灵芝醇提物的清除能力大于水提物。虽然从总体上看,无柄灵芝对DPPH自由基的清除率会略大于赤芝,但没有显著性差异(P>0.05)。

四种灵芝提取物对羟自由基清除率如图3C。由于Fe2+与H2O2混合可以产生·OH,水杨酸是最常用的捕获剂,故使用水杨酸将其捕获,并产生有色物质。若加入具有清除·OH能力的样液,则会与水杨酸竞争·OH,使得有色物质产量降低,可以看出:无柄灵芝和赤芝提取物都具有一定的清除羟自由基的能力,但两种灵芝的水提物清除率都偏低。在同一品种不同提取方法的情况下,赤芝水提物与赤芝醇提物的清除能力具有显著性差异(P<0.05),无柄灵芝的水提物和醇提物之间存在显著差异(P<0.05),无柄灵芝醇提物对羟自由基的清除能力强于无柄灵芝水提物;在不同品种同一提取方法的情况下,对羟自由基的清除能力,赤芝水提物和无柄灵芝水提物之间没有显著性差异(P>0.05),赤芝醇提物和无柄灵芝醇提物之间存在显著性差异(P<0.05)。

图3 两种灵芝不同提取物相同浓度对三种自由基的清除能力

无柄灵芝与赤芝的醇提取物比这2种灵芝的水提取物具有较高的自由基清除活性。通过相关性分析可知,ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率和羟自由基清除率与三萜含量的相关性值分别为0.907、0.922、0.972;说明无柄灵芝醇提取物中的三萜类物质与其抗氧化性正相关。梁磊等的研究结果显示,灵芝三萜对DPPH自由基清除效果优于茶多酚,具有较强的清除自由基活性[35]。李田田等[36]对树舌灵芝研究表明在同等剂量下,三萜的抗氧化能力要强于多糖。本文的结果与他们的结果相似,因此,可以进一步推测无柄灵芝的抗氧化能力与其三萜类物质有关。

3 结论

本试验对比分析了无柄灵芝与赤芝这两种灵芝不同提取物中的总糖、总三萜、总游离氨基酸的含量及在同等浓度下对三种自由基的清除能力,发现不同灵芝子实体的不同的提取溶剂提取物中这三种物质组成存在差异。两种灵芝在总糖和总游离氨基酸方面,水提取物的含量比醇提取物的含量高,而在三萜方面,无柄灵芝水提取物的含量却比醇提取物的含量低。另外,赤芝的提取物的总糖含量比无柄灵芝的提取物高;而无柄灵芝提取物的总三萜含量比赤芝的高。在总游离的氨基酸方面,无柄灵芝的提取物的含量比赤芝的高。在清除ABTS自由基、DPPH自由基、羟基自由基方面,两种灵芝的提取物都具有一定的清除能力,并且醇提物要比其水提物的清除效果较好。因此,在今后的不同功能成分的提取开发方面,应考虑使用不同的溶剂提取。本研究结果为今后进一步开发利用无柄灵芝提供了数据支持。