非生物胁迫对发芽谷物多酚的影响研究进展

徐 汇,梅 新,李书艺,祝振洲,施建斌,蔡 沙,熊 添,隋 勇,*

(1.湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所,湖北武汉 430064;2.武汉轻工大学食品科学与工程学院,湖北武汉 430023)

全谷物是指从禾本科植物的果实中分离出来的可食用种子。禾本科植物包括小麦科(大麦、黑麦、小麦和黑小麦)、稻科(水稻)、燕麦科(燕麦)和高粱科(高粱和玉米)等主要谷类,还包括小米等次要谷类。研究表明,全谷物食品能有效降低心脏病[1]、Ⅱ型糖尿病[2-3]、炎症[4]的发病率,这可能与其富含纤维、维生素、矿物质、及多酚类化合物有关[5]。除此之外,萌发或发芽的谷物如果含有麸皮、胚芽和胚乳,且营养价值没有下降,发芽长度不超过谷粒,则也可以被归类为全谷物或发芽谷物[6]。

谷物发芽时,淀粉酶将直链淀粉和支链淀粉水解成单糖,使其具有较高的消化率。与此同时贮藏蛋白吸水后被蛋白酶水解成肽和氨基酸,从而提高了生物利用度[7]。发芽过程中植酸酶的活性增加,降解了多余的植酸盐,从而提高了矿质元素的生物利用率。研究表明,发芽能显著促进谷物中GABA的积累[8-9]和总多酚含量的增加[10],谷物合成GABA后能调节机体的生长发育,维持pH稳定,抑制细胞液的酸化,还能储藏氮源,同时利用多酚类化合物来清除部分自由基,缓解胁迫过程产生的氧化应激。发芽是一个广泛应用于豆类和谷物的过程,以提高它们的适口性和营养价值[11]。

谷物中的多酚类化合物包括酚酸、花青素、醌类、黄酮醇、查耳酮、黄酮、黄烷酮类等[12]。其中酚酸主要以游离态和结合态形式存在于种皮及胚中,在种子萌发过程中,酶的合成和核的修饰会导致酚类化合物含量的提高和抗氧化活性的增强。研究表明,谷物发芽后总酚及游离酚含量显著提升,其中阿魏酸、对香豆酸、咖啡酸等肉桂酸化合物增加明显,这可能与发芽期间苯丙烷代谢活动增强及共轭酚酸的水解有关[13-15]。同时酚类化合物因其良好的抗氧化性、抗炎症及抗癌作用已被广泛研究。赵彬[16]通过体外实验研究高粱酚类化合物的抗癌作用,结果表明,高粱酚类化合物可以诱导 Caco-2细胞凋亡从而抑制癌细胞增殖。燕麦蒽酰胺是只存在于燕麦中的酚类化合物,Nie等[17]发现燕麦多酚类化合物之一燕麦蒽酰胺-c可以抑制血管平滑肌细胞的增殖,从而减慢动脉粥样硬化的过程。Nguyen等[18]的研究表明高粱酚类化合物可以抑制细胞中一氧化氮的合成,从而减少炎症的发病率。Merendino等[19]发现自发性高血压大鼠食用含有苦荞芽的意面后血压水平有所改善,这可能与其芦丁及槲皮素含量较高有关。

非生物胁迫是指由于自然环境发生改变,导致植物体内生理生化状态发生改变,严重时会导致性状的改变。几种常见的非生物胁迫类型有:矿物质胁迫、盐胁迫、温度胁迫(高温胁迫和低温胁迫)、水分胁迫(水分胁迫和干旱胁迫)等[20]。近年来还增加了一些新型技术手段,如超声胁迫、等离子体胁迫和光胁迫等。为了获得植物化学成分含量高的优质谷物,可以在发芽过程中使用非生物胁迫手段调节植物的生长发育。种子萌发过程中受到胁迫后会加剧活性氧的产生,从而破坏种子中DNA、蛋白质、脂质等大分子的结构,此时机体的防御系统会合成抗氧化剂(如酚类物质)来清除活性氧,保护机体免受胁迫损害。

研究发现,非生物胁迫可以作为辅助手段促进谷物发芽时积累多酚类化合物这一过程[21]。为了明确谷物发芽过程中多酚类化合物的种类,有必要对发芽谷物受到非生物胁迫时多酚类化合物的变化进行整理,以便于定向地获取多酚类化合物。由于目前国内研究非生物胁迫谷物发芽的文章有很多,传统的盐胁迫和矿物质胁迫[22-25]大多是为了在提高农作物的抗逆性和富集营养物质,如花青素、γ-氨基丁酸[26]和硒[27]等,研究发芽过程中多酚类化合物的文章则十分有限。因此本文综述了一些非生物胁迫谷物发芽后多酚类化合物的变化,旨在为谷物中酚类化合物的深度研究提供依据,也为发芽谷物的研究提供新的可利用资源。

1 发芽对不同谷物多酚含量及组成的影响

发芽是指谷物从吸涨开始的一系列有序的生理过程,主要包括吸涨、萌发、出苗3个阶段。谷物萌发后发生了许多生理生化变化,如种皮覆盖度减弱、代谢活动开启、基因转录激活、胚胎细胞壁松弛和细胞器的重新组装。这意味着可食用部分发生了重要的生化、营养和感官变化。与未发芽的种子相比,所产生的初级和次级代谢产物对生物健康的影响是不同的。发芽的谷物被认为比未发芽谷物具有更大的营养和生理价值。

1.1 糙米

糙米是指稻谷脱除颖壳后还保留种皮、糠层、胚和胚乳的全谷粒米。邵雅芳[28]用高效液相色谱法对白米、黑米、红米等糙米中的酚酸进行定量分析,检测到稻米中常见的酚酸有香草酸、原儿茶酸、对香豆酸、反式对香豆酸、紫丁香酸、反式芥子酸、异阿魏酸、阿魏酸等,但是每个品种中酚酸的种类不同,3个品种中都检测出来了异阿魏酸、阿魏酸、对香豆酸和紫丁香酸,而香草酸只在黑米中检测出来,原儿茶酸也只在黑米和红米中存在。Albarracín等[29]的研究显示,糙米发芽后游离酚和结合酚的含量增加,抗氧化能力得到增强,同时发芽还可以显著降低植酸的含量,可以用来开发全谷物食品。吴凤凤[30]以江苏地区最具代表性的3种水稻为研究对象,探究糙米发芽过程营养物质的变化,结果发现,随着时间的延长,发芽糙米多酚的含量持续增加,发芽5 d之后,3种水稻的多酚含量都提高了40%左右。

1.2 燕麦

燕麦是最好的全谷物食品之一,含有丰富的蛋白质、必需脂肪酸和维生素,可以调节人体血糖和血脂水平。已有研究表明,燕麦中含有各种酚酸和少量的黄酮类化合物,燕麦蒽酰胺是只存在于燕麦中的多酚类物质。燕麦中已发现的酚酸有阿魏酸、咖啡酸、对香豆酸、水杨酸、对羟基苯甲酸、没食子酸、香草酸、4-羟基苯乙酸、丁香酸、原儿茶酸、芥子酸等[31-32]。付晓燕等[33]的研究表明发芽能改变燕麦中酚类化合物的种类,未发芽的样品中主要含有香草酸、芥子酸、丁香酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸等,发芽后这些酚酸明显减少,只在发芽6 d的样品中检测到阿魏酸和香草酸,而燕麦蒽酰胺的相对含量上升了74%,说明发芽能提高燕麦蒽酰胺的含量。赵霞等[15]的研究表明,燕麦发芽6 d后酚酸和蒽酰胺明显提高,其中苯甲酸的含量提高了80%左右,这些结果表明发芽可以促进燕麦中多酚类化合物和燕麦蒽酰胺的积累。闵维[34]研究了燕麦萌发过程中总酚的变化,结果发现,在萌发初期燕麦总酚含量有所下降,但随着发芽时间的延长,总酚含量又会增加,这可能是由于发芽初期多酚氧化酶活性较高,降解了部分多酚,发芽后苯丙氨酸解氨酶被激活,又合成了新的多酚类化合物。

1.3 荞麦

荞麦富含蛋白质、脂肪、碳水化合物、矿物质、维生素、多酚类化合物,具有抗氧化、降血脂、抗癌、抗菌消炎等药理效果,是为数不多的药食两用资源之一。研究表明荞麦的总酚含量高于藜麦和小麦,槲皮素是荞麦种子中最主要的多酚类物质,其次是儿茶素,另外还包括两种咖啡酸和丁香酸衍生物[35]。Ren等[36]的研究发现普通荞麦和苦荞发芽后总酚含量都增加了,且总酚和游离苯丙氨酸含量也有相同的趋势。凌阿静[37]的研究表明荞麦发芽10 d后总酚含量是未发芽籽粒的8.04倍,未发芽的荞麦种子中只检测出槲皮素、阿魏酸和芦丁,其中芦丁含量最高,而在发芽的样品中检测出了新的酚酸:丁香酸和绿原酸,说明发芽可以显著提升荞麦中酚类化合物的含量。

1.4 小麦

小麦也是最受欢迎的主食之一。Hung等[38]的结果表明,2种加拿大小麦发芽前后都含有7种酚酸(4-羟基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、对香豆素、阿魏酸和芥子酸),小麦发芽后游离酚酸含量增加,而结合酚酸含量减少,但总酚含量是增加的,这可能是由于发芽过程中丁香酸含量增加引起的。与普通小麦相比,黑小麦含有更多地花色苷、膳食纤维、微量元素和维生素等生物活性物质,属于优质谷物资源。甘人友等[39]以高效液相色谱法为基础鉴别发芽黑小麦中的多酚类化合物,结果显示,对香豆酸和阿魏酸是黑小麦种子和发芽黑小麦中主要的酚类化合物。发芽0～2 d时,酚酸含量的变化不明显,从第3 d开始明显增加,并在第8 d达到最高水平。其中对香豆酸的含量增加到原来的35倍,阿魏酸的含量增加到原来的4.5倍,这说明发芽可以显著增加对香豆酸和阿魏酸的含量,其作用机制可能与可溶性对香豆酸和阿魏酸的生物合成及其向植物细胞壁的转运有关。

1.5 大麦

大麦及麦芽有许多药理性作用,如降血糖、降血脂、助消化等,主要用来酿造啤酒和用作饲料。朱丽丽[40]的研究表明,大麦发芽后单酚的含量都有所增加,在大麦和麦芽中,儿茶素的含量始终最高,而槲皮素的含量最低,发芽后阿魏酸、没食子酸、芥子酸、原儿茶素、咖啡酸、丁香酸和表儿茶素的含量都显著上升,槲皮素有所减少,对香豆素和儿茶素的含量则没有显著变化。李苇舟等[41]用高效液相色谱法鉴定8种大麦发芽前后多酚类化合物的变化,大麦和麦芽中多酚类物质主要以游离态形式存在,大麦发芽后游离酚中阿魏酸的含量显著高于未发芽的大麦,结合酚中阿魏酸、原儿茶酸、香草醛等都显著增加,还检测出了槲皮素。此次试验还检测到Metcalf品种大麦发芽后合成了新物质荭草素。

2 非生物胁迫诱导发芽谷物多酚积累

2.1 盐胁迫

盐胁迫最直接的结果是细胞渗透压发生改变,影响细胞稳态。研究表明,植物次生代谢物水平的变化,包括酚类化合物和萜类物质,增强了植物对胁迫的防御机制[42],特别是高盐浓度下的氧化应激。萌发通常被认为是植物生命周期中对盐最敏感的阶段,盐浓度的改变会影响植物体正常的生长代谢。Stagnari[43]的结果证实了可以通过调节小麦萌发过程中环境的盐浓度来提高多酚类物质的含量。Lim等[44]的研究表明,每天向荞麦芽喷洒100 mL不同浓度的NaCl溶液,7 d后荞麦芽的酚类含量明显高于对照组,且酚类化合物的积累主要是由异荭草素、荭草素、芦丁和牡荆素的增加引起的。谷物发芽后酚类化合物和GABA的含量都会增加,但Ma等[45]的结果表明,盐胁迫条件下,外源GABA显著增加了大麦芽中酚类化合物的含量,这可能是由于GABA对NaCl胁迫诱导的大麦麦芽中苯丙氨酸酶类的合成起着重要作用。

2.2 超声波预处理

超声波是指频率大于20 kHz的机械振动在固体、液体、气体等介质中传递的弹性波,它能在传播的介质中引起空化效应、热效应和机械效应,从而使物质受到不同程度的热和力的作用,产生多种物理化学效应。张祎等[46]在糙米发芽不同阶段进行超声波处理,结果表明,超声处理组发芽10 h后多酚含量显著增加,直到25 h时趋于平稳,而未超声组发芽16 h后才开始显著增加,32 h时趋于平稳,此时超声发芽组比对照组多酚含量提高了8%,说明超声波处理能缩短发芽时间,促进多酚的积累。Ding等[47]用超声波处理发芽燕麦,研究发现,燕麦发芽过程中总酚含量显著增加,在第4 d时达到最大值,超声组和未超声组中总酚含量分别是生燕麦的2.8和3.2倍。说明燕麦发芽后可以显著提高总酚的含量。

2.3 低温处理

在低温胁迫下,植物的表皮细胞比其他组织更易受到寒冷的影响,导致活性氧(ROS)在这些细胞中积累,这些ROS会对磷脂膜、蛋白质和核酸造成细胞损伤,还可能引起细胞脱水,但此时表皮细胞会合成大量的花青素来清除活性氧,降低细胞的渗透电位,延缓细胞冻结。多项研究表明,低温胁迫能够促进植物种子在发芽过程中酚类物质的积累,相比于正常25 ℃发芽,10 ℃低温胁迫发芽葡萄种子中缩合单宁、儿茶素、没食子酸等酚类物质含量显著升高;大豆在低温下发芽,其异黄酮及阿魏酸、对香豆酸等酚酸含量也显著增加[48-49]。而有关低温胁迫对发芽谷物多酚影响的研究鲜见报道。Li等[50]先在25 ℃、50%湿度的条件下室内培养苦荞芽8 d(其中光照14 h/黑暗10 h)。然后,这些芽在不同的温度下分别再生长4 d(一组25 ℃,另一组4 ℃),收集样品。研究发现,冷胁迫芽的子叶和下胚轴中花青素的含量几乎是室温培养下的4倍,且花青素主要积累在胚轴组织中。这是由于冷胁迫增加了苦荞芽中花青素生物合成基因的表达,而花青素的积累与抗氧化活性呈正相关,可保护苦荞芽不受低温胁迫的伤害。

2.4 光胁迫

光照是影响植物生长发育的主要因素之一。就发芽而言,在种子发芽期间使用发光二极管(LEDs)是提高幼苗营养质量的有效策略[51]。发光二极管具有波长特异性,可用于从近紫外(UV)到近红外(IR)的光谱范围。因此,可以通过选择特定的波长来获得光谱,来最大限度地积累特定的化合物。Lee等[52]评估了红色(R)、蓝色(B)、红色+蓝色(R+B)灯对荞麦芽中酚类化合物的影响,他们将普通荞麦和苦荞的种子在25 ℃、60%相对湿度的黑暗条件下室内培养3 d,然后移进玻璃装置里培养3 d,玻璃装置具有自动供水系统且只允许5%的阳光透过,然后在不同颜色的光照条件下继续培养至9或12 d。在普通荞麦芽中检测到有6种不同的酚类化合物(黄酮碳苷、绿原酸、芦丁、牡荆素、异牡荆素、荭草素和异荭草素),普通荞麦芽和生长在不同LED灯下的荞麦芽的总酚含量明显不同,且总酚的积累量红>红+蓝>蓝灯。在苦荞芽中除了检测到普通荞麦芽中的6种多酚外,还检测到了槲皮素,不同LED灯下生长的苦荞芽总酚含量无差异。在R、B和R+B发光二极管下生长的苦荞芽中的芦丁的含量是普通荞麦芽中的6倍,这说明LED灯的应用可能会促进荞麦芽中酚类化合物的产生。Thwe等[21]研究了发光二极管(LEDs)对苦荞芽生长发育的影响,所有基因在LED照射2 d后的转录水平最高,在红色LED照射10 d后儿茶素的含量最高,与白色或红色LED灯相比,蓝色LED灯增强了花青素的积累,说明LED灯对提高荞麦芽中酚类物质是有效的,特别是儿茶素和花青素的含量。Tsuranaga等[53]研究了不同光照条件对荞麦芽中花青素和芦丁的影响,结果发现,UV-B>300 nm时照射荞麦芽提高了花青素和芦丁的含量,但波长为260～300 nm时,在24 h内会出现黄变或枯萎现象,说明在此波长范围内的光照对荞麦芽的生长不利。

2.5 等离子体处理

等离子体是一种中性电离气体,是继固体、液体和气体之后物质的第四种介质。近年来,冷等离子体已成功地应用于植物种子的处理。这种处理可以改变种子的湿润性,从而使种子发芽更快,产量更高。Yodpitak等[54]用低温等离子体处理发芽糙米,发现发芽后总酚含量有所提高,推测低温等离子体处理可以促进花青素的积累,但发芽4 d后总抗氧化能力下降了50%,这可能是由于pH、光照、活性氧种类、酶和热条件等不同因素对花青素的降解,在pH为2.0时,花青素的稳定性最高,pH的增加可能会降低花青素的稳定性。

2.6 低氧处理

低氧发芽的水稻中酚类化合物的含量高于普通发芽水稻。这是因为在缺氧的压力下,机体会产生高度活泼的自由基,但植物体可以利用自身抗氧化防御机制机制合成酚类化合物、生育酚、抗坏血酸和谷胱甘肽等低分子量抗氧化剂来消除自由基,这个过程促进了酚类化合物的积累[55]。Techo等[56]的研究表明,浸泡后的水稻在低氧的条件下(稻米和密封罐的体积比分别为1∶4、1∶2、3∶4、4∶4)发芽,样品的酚类物质含量随发芽时间的延长而显著增加,这可能是由于苯丙氨酸解氨酶(PAL)在发芽过程中被诱导,合成多种酚类化合物[57]。王艳[58]在三种糙米(白米、黑米和红米)发芽过程中使用无氧处理,研究发现,三种糙米发芽后总酚含量显著增加,其中白米的游离酚含量有所下降。阿魏酸是发芽糙米中含量最丰富的的酚酸,其次是芥子酸和对香豆酸,无氧处理后,红米和白米中这三种酚酸的含量显著增加,而黑米中芥子酸和阿魏酸的含量没有明显变化,只有对香豆酸含量有所增加。

3 非生物胁迫影响发芽谷物多酚积累的机理

已有研究表明,大多数酚类化合物是通过苯丙途径产生的,而苯丙途径容易受到生物和非生物胁迫的刺激。为了解决胁迫带来的负面影响,植物诱导产生内源激素(包括茉莉酸及其甲基化衍生物)来激活苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase,PAL)等参与苯丙途径的酶合成酚类化合物[59]。酚酸和类黄酮的生物合成都起始于苯丙氨酸[25]。苯丙氨酸通过苯丙氨酸解氨酶(PAL)和肉桂酸-4-氢化酶(cinnamate-4-hydroxylase,C4H)的催化作用合成对香豆酸,然后分别合成酚酸和类黄酮。PAL、4-羟基肉桂酸3-羧化酶(4-hydroxycinnamate 3-hydroxylase,C3H)、4-香豆酰辅酶 A 连接酶(4-coumarate-CoA ligase,4CL)、5-羟基阿魏酸盐-O-甲基转移酶(5-hydroxyferulate-O-methyltransferase,COMT)、阿魏酸盐5-羧化酶(Ferulate-3-hydroxylase,F5H)和羟基肉桂醇脱氢酶(Hydroxycinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD)是合成酚酸的关键酶类。而查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)、查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)、类黄酮-3-羟基转移酶(flavonoid-3-hydroxylase,F3H)、类黄酮-3′-羟基转移酶(flavonoid-3′-hydroxylase,F3′H)、二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)、花青素合成酶(anthocyanidin,ANS)、花青苷还原酶(anthocyanidin reductase,ANR)、类黄酮3-O-葡糖苷转移酶(flavonoid 3-O-glycosyltransferase,FGT)和S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,A3′M)是合成类黄酮的主要酶类。

非生物胁迫影响发芽谷物积累多酚是通过调控相关基因的表达来完成的,如冷胁迫增加了苦荞芽中所有花青素生物合成基因的表达,苯丙途径的晚期生物合成基因中FtF3’H、FtDFR、FtANS等基因的表达水平显著高于其他基因[50];在蓝光、白光和红光照射下所有苯丙氨酸类通路的基因(如FtPAL、FtC4H、FtANS等)在荞麦芽发育早期都有高表达,且蓝光下生长的芽有更高的转录水平,这与蓝光照射下花青素含量更高一致[11];盐胁迫通过积累内源性茉莉酸和激活PAL来合成酚类化合物[60]。

4 结论及展望

谷物营养价值高,富含膳食纤维、维生素和矿物质,发芽可以显著提高谷物中各营养元素的含量,用来开发功能食品。非生物胁迫处理后谷物的发芽率、生长参数、根长和苗高均有不同程度的提高,还可以缩短发芽周期,减少积累GABA和多酚等生物活性物质所需要的时间。但过量的胁迫处理对发芽谷物的生长是不利的,如盐胁迫时浓度过高会降低荞麦芽的生长速度。还应关注非生物胁迫对谷物细胞结构的影响,糙米超声处理后糙米表面出现了裂纹和孔洞[61],燕麦超声处理后淀粉溶出[47],这对谷物的改性有积极的影响,但对谷物发芽后能否正常成熟结果等还有待研究。还可以探究多种非生物胁迫手段联合使用对发芽谷物多酚结构及活性的影响,为全谷物的应用提供广泛的基础。与此同时还可以展开一些相关的研究,探讨植物体内合成多酚类物质的酶及基因的变化,这有利于科学地研究酚类物质变化的机理。