碱蓬多糖SSP1-1的分离纯化及其抗肿瘤活性

李晶晶,刘欣鑫,薛 阳,崔 錾,*

(1.锦州医科大学附属第一医院,辽宁锦州 121000;2.锦州医科大学医疗学院,辽宁锦州 121000)

碱蓬(Suaedasalsa)是一种黎科植物,又名翅碱蓬,为一年生叶肉质化草本植物。碱蓬营养价值丰富,其中含有各种有助于人类健康的成分,例如脂肪酸、黄酮、色素、蛋白质和无机盐等生物大分子[1]。由于其经济作用和研发价值前景广阔,碱蓬的研究和开发在许多领域备受瞩目。多糖是动物、植物和微生物生长过程中必不可少的一种生物大分子。通常是由10个以上相同或者不同的单糖分子通过糖苷键缩聚而成的高分子聚合物[2]。天然多糖的生物活性十分广泛,如免疫调节、降血糖、抗氧化和抗肿瘤等,此外,天然多糖还具有药理稳定性和低毒性等优点,这些优势使其在食品和药物开发中占据首要地位。随着社会的进步,推进了科学研究的发展,多糖生物功效多样性的研究受到国内外广泛关注。

肿瘤是由正常细胞的异常生长和扩张引起的高发病率和高死亡率的疾病。近几年,我国肿瘤的发病率逐步上升,严重地威胁了人们的生活和健康[3]。目前,手术治疗与化疗是治疗肿瘤的主要途径,但是手术治疗风险高,化疗药物通常会引起患者恶心呕吐、免疫损伤等严重的副作用。因此,开发一种不良反应小,治疗效果好的天然抗肿瘤药物势在必行。目前,对碱蓬多糖的分离纯化已见报道,但对于其生物活性的研究主要集中在抗氧化和免疫活性等方面。王昭晶[4]从碱蓬中提取出两组均一组分多糖SPA和SPB,并证明其有超氧阴离子清除作用和羟自由基清除作用;庞庭才等[5]通过NaOH溶液提取碱蓬多糖,并对其抗氧化活性进行探讨。刘素华等[6]利用热浸提法提取碱蓬多糖,得到的多糖平均分子量为2.52×106Da;并证明碱蓬多糖具有良好的体外抗氧化活性,以上研究中,仅对碱蓬多糖体外抗氧化活性相关内容进行了初步研究,未对碱蓬多糖抗肿瘤活性进行相关研究。本文以碱蓬为原料,通过DEAE-52纤维素柱和Sephadex G-75葡聚糖凝胶柱得到一种均一且分子量明确的碱蓬多糖SSP1-1,并利用MTT、Hoechst 33342染色、Western blot方法对该多糖的抗人肝癌细胞HepG2活性进行研究,以期为碱蓬多糖的开发利用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

碱蓬 辽宁省锦州市凌海大桥下沿海滩涂湿地,经锦州医科大学附属第一医院韩冠英教授鉴定为碱蓬属碱蓬草;HepG2细胞、L-02细胞 中国科学院上海细胞库;胎牛血清、DMEM细胞培养基、胰酶和PBS Gibico公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒、Hoechst 33342染色液、RIPA裂解液 Beyotime公司;DEAE-52纤维素柱、Sephadex G-75葡聚糖凝胶色谱柱 GE Healthcare公司;T系列不同分子量的葡聚糖标准品(T-5,T-10,T-50,T-70 和T-500,纯度≥98%) 上海原叶生物科技有限公司;浓硫酸、95%乙醇、浓盐酸和苯酚等试剂 均为国产分析纯。

真空冷冻干燥机、BS-100A自动部份收集器 上海一恒公司;680型全自动酶标仪、凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 碱蓬粗多糖的制备 称取粉碎后的碱蓬粗粉50 g,加入300 mL的80%乙醇回流脱脂2次,每次2 h,过滤取沉淀物,置于烘箱内45 ℃烘干。取烘干后的碱蓬粉末,加入500 mL纯化水于80 ℃水浴锅中加热回流提取2次,每次3 h。收集滤液并在60 ℃下减压浓缩,离心(3000 r/min,15 min)后取上清液;利用活性炭吸附法进行脱色,Sevage法脱蛋白,在溶液中加入3倍量的50%乙醇溶液,4 ℃下放置24 h,离心(3000 r/min,20 min)取沉淀;用乙醇和丙酮将沉淀物洗涤干净后进行冷冻干燥,得碱蓬粗多糖[7]。

1.2.2 碱蓬粗多糖的分离纯化 取200 mg碱蓬粗多糖溶于100 mL纯化水中,溶解,过0.45 μm微孔滤膜。将处理后的样品加载到DEAE-52纤维素离子交换柱上,分别配制0、0.2、0.4、0.6、0.8 mol/L NaCl溶液作为洗脱溶液进行洗脱,流速为1 mL/min,每10 mL收集一管。边收集边利用苯酚-硫酸法跟踪检测收集液的OD490,收集单一组分,冷冻干燥,用于进一步分离纯化。取上述实验步骤中的单一组分100 mg溶于100 mL双蒸水中,溶解,过0.45 μm微孔滤膜,将处理好的样品加载到Sephadex G-75葡聚糖凝胶柱,用蒸馏水进行洗脱,流速为0.5 mL/min,每5 mL收集一管。检测方法同上,收集单一洗脱峰、浓缩、冷冻干燥,得到单一组分碱蓬多糖。

1.2.3 碱蓬多糖分子量及纯度鉴定 通过高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)对碱蓬多糖的分子量及纯度进行鉴定,使用TSK-gel G3000PWxl(7.5 mm×300 mm)柱和Agilent-LC 1200体系,配备折射率检测器(RID)[8]。取单一碱蓬多糖溶解于蒸馏水中,配成初始浓度为1.5 mg/mL的溶液,过0.45 μm微孔滤膜,进样量为20 μL,流动相为0.05 mol/L NaCl,流速为0.5 mL/min。T系列不同分子量的葡聚糖标准品(T-5,T-10,T-50,T-70和T-500)配制成浓度为1.5 mg/mL的标准溶液,按上述相同方法进行检测。以色谱峰的保留时间(Rt)为横坐标,葡聚糖标准品的平均分子量的对数值(logMw)为纵坐标进行线性回归。

1.2.4 细胞培养 将HepG2细胞和L-02细胞分别在DMEM完全培养液中培养(含10%胎牛血清、青霉素和链霉素50 μg/mL),并将细胞放置在在37 ℃、饱和湿度、含5% CO2的孵育箱中培养24 h,将处于对数生长期的HepG2细胞和L-02细胞用于下面的体外实验研究。

1.2.5 碱蓬多糖对肿瘤细胞的抑制作用 将对数生长期的细胞用胰酶消化下来,加入配置好的培养基使细胞悬浮,吹打均匀。分别将HepG2细胞和L-02细胞以1×104cell/mL的密度接种到96孔培养板中[9]。置于CO2恒温培养箱24 h后加入不同浓度的碱蓬多糖SSP1-1(终浓度为 0、50、100、200、300和500 μg/mL),分别培养24和48 h后,加入0.5 mg/mL的MTT,每孔20 μL,4 h后吸出上清液,并每孔加入200 μL DMSO,避光振荡20 min,通过酶标仪检测570 nm处的吸光值,计算细胞活力。计算公式如下:

1.2.6 Hoechst 33342细胞染色 通过细胞计数,将HepG2细胞的密度调整为5×104cell/mL,接种到24孔板中,每孔加入不同浓度的SSP1-1(0、100、200和500 μg/mL),放入培养箱孵育24 h,用PBS清洗2次后用核染料Hoechst 33342染色,荧光显微镜观察细胞核的形态。

1.2.7 Western blot实验 利用培养皿培养细胞,待细胞长到80%后加入不同浓度的SSP1-1(终浓度为0、100、200和500 μg/mL),培养24 h后收集细胞。利用BCA蛋白检测试剂盒测定总蛋白浓度。将上样缓冲液在沸水中加热10 min使细胞蛋白质变性。将20 μL蛋白质样品加载到SDS-PAGE凝胶上并转移到0.45 μm PVDF膜上[10]。随后,用1% BSA溶液在室温下封闭2 h,将PVDF膜在4 ℃下与相应的一抗(一抗工作浓度1∶1000)孵育24 h,TBST洗涤3次,在室温下与相应的二抗(二抗工作浓度1∶10000)孵育2 h,浸入配好的ECL显影液中,随后取出曝光检测。

1.3 数据处理

使用SPSS 19.0软件对数据进行单因素方差分析(ANOVA),P<0.05表明统计学具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 碱蓬粗多糖的分离纯化及纯度鉴定

本实验通过水提醇沉提取法得到碱蓬粗多糖SSP,通过DEAE-52纤维素色谱柱分离粗多糖SSP,得到两个洗脱组分,其中水洗脱部分命名为SSP1,0.2 mol/L NaCl洗脱部分命名为SSP2,洗脱曲线见图1。本课题组在之前的实验中已经对SSP2进行研究[7],因此本实验将对SSP1进行研究,SSP1经Sephadex G-75葡聚糖凝胶过滤色谱法进一步纯化,得到单一洗脱组分SSP1-1,洗脱曲线如图2所示,收集组分SSP1-1并用于后续实验的分析。

图1 DEAE-52纤维素交换柱洗脱曲线

图2 Sephadex G-75葡聚糖凝胶柱洗脱曲线

以多糖标准品分子量的对数值对保留时间绘制标准曲线,得到线性回归方程为logMw=-0.2344Rt+6.7682,R2=0.9994。碱蓬多糖分子量色谱图如图3所示,由于高效凝胶渗透色法(HPGPC)测量多糖纯度和分子量的灵敏度高,可靠性大[11-12],所以SSP1-1组分为单一对称峰,表明SSP1-1为均一多糖,保留时间为8.48 min,通过线性回归方程计算其分子量为60.32 kDa。

图3 碱蓬多糖分子量测定色谱图

2.2 碱蓬多糖对肿瘤细胞的抑制作用

通过MTT测定SSP1-1对HepG2细胞的细胞活力的影响。从图4A可以看出,HepG2细胞活力随着SSP1-1浓度的增加逐渐下降(P<0.05)。当浓度为500 μg/mL时,HepG2细胞在24 h和48 h的细胞活力分别为52.8%和50.2%。这个结果表明,相同浓度的SSP1-1对HepG2细胞的抑制作用会随着作用时间的延长而逐渐增强。从图4B可以看出,在用SSP1-1处理24 h后,L-02细胞的活力基本不受影响。此外,当SSP1-1浓度大于100 μg/mL时,HepG2和L-02细胞的活力明显不同。综上所述,SSP1-1通过浓度和时间依赖性的方式抑制HepG2细胞的增殖,并且对正常细胞L-02的增殖没有影响。

图4 细胞活力检测

2.3 SSP1-1诱导肿瘤细胞形态学改变

为了进一步鉴定SSP1-1对HepG2细胞的生长抑制作用是否与诱导凋亡有关,对细胞形态学特征进行研究。将经不同浓度的SSP1-1处理的HepG2细胞利用荧光染料Hoechst 33342进行染色,在荧光显微镜下观察HepG2细胞核的形态。从图5可以看出,随着SSP1-1浓度的增加,细胞核的形态变化逐渐明显。对照组的细胞核一般为均匀的椭圆形状,在分别用浓度为100、200、500 μg/mL的SSP1-1处理HepG2细胞后,随着浓度的增加细胞受损程度逐渐严重并观察到典型的核凋亡形态。在浓度为100 μg/mL时,可见细胞核皱缩,在浓度为200 μg/mL时,细胞核皱缩数量增加,形态变化更加明显,在浓度为500 μg/mL时,细胞核出现碎裂,这可能与多糖具有引起肿瘤细胞核皱缩,染色质压缩和核碎裂成小圆体等作用有关[13]。

图5 Hoechst 33342染色图(×200)

2.4 Western blot实验

通过Western blot法检测SSP1-1通过何种途径诱导HepG2细胞发生凋亡。随着Bcl-2、Bax和Caspase-3在细胞凋亡信号传导过程中关系研究的进一步深入,发现Bcl-2、Bax不但可以作为Caspase-3上游调控机制,参与对Caspase-3活性的调节,还可以作为Caspase-3的直接底物作用于Caspase-3的下游,二者在细胞凋亡过程中相互联系又相互制约[14]。因此,本文对Bax、Bcl-2和Caspase-3等蛋白表达情况进行检测。如图6所示,随着SSP1-1浓度的增加,Bax的表达水平逐渐升高,Bcl-2的表达水平逐渐降低,Caspase-3的表达进一步增强,同时发现3种蛋白的表达均呈剂量依赖性(P<0.05)。

图6 Western Blot实验结果

3 讨论与结论

本文利用水提醇沉法提取出碱蓬粗多糖SSP,通过DEAE-52纤维素色谱柱和Sephadex G-75葡聚糖凝胶色谱柱得到一种水溶性多糖SSP1-1,分子量为60.32 kDa。研究表明植物多糖对人肝癌HepG2细胞的增殖具有明显的抑制作用,王景春等[15]通过水提醇沉法提取出川芎多糖,并证明川芎多糖对HepG2细胞有明显的体外活性抑制作用,并推测其是通过将肿瘤细胞阻滞在G1期从而诱导其凋亡;张多强等[16]证明枸杞多糖可抑制HepG2细胞增殖并同时诱导肿瘤细胞自噬。综上所述,植物多糖可以抑制HepG2细胞的增殖,并随着浓度的增加呈剂量依赖性。本实验通过对SSP1-1进行抗肿瘤活性验证,发现SSP1-1具有抑制HepG2肿瘤细胞增殖作用并对正常细胞L-02毒性较低,具有在治疗过程中的减少副作用的潜力。

MTT比色法可以反映出活细胞的数量,利用酶标仪检测560 nm处96孔板中细胞的吸光度值,来检测细胞的生存活力[17]。本实验通过MTT法测定SSP1-1对HepG2细胞生存活力的影响,结果表明SSP1-1呈剂量时间依赖性的抑制HepG2细胞的增殖,并且对人体正常肝细胞系L-02的增殖无明显影响,可以说明SSP1-1具有抗肿瘤活性,并不影响正常细胞的增殖。此外,通过观察经Hoechst 33342染色后的HepG2细胞核的形态变化,可以看到经过SSP1-1诱导处理的HepG2细胞的细胞核具有典型的凋亡形态。通过检查Bcl-2和Caspase基因家族编码的蛋白质的表达,是确定细胞是否凋亡的主要指标[18]。Bax、Bcl-2共属于Bcl-2基因家族,Bax基因在人体凋亡基因中起到关键性作用,Bax在促进细胞凋亡的同时还可以拮抗Bcl-2的抑制细胞凋亡[19-21],Bcl-2家族蛋白质分为促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白,是调节线粒体途径的关键蛋白。促凋亡成员和抗凋亡成员两者之间的表达水平的平衡直接影响细胞存活或细胞凋亡[22-24]。因此,确定细胞是否发生凋亡的重要指标是检测Bax与Bcl-2两蛋白之间的比值。此外,Caspase-3蛋白酶存在于细胞质中,参与细胞的生长、分化与凋亡调节,作为关键介质调节程序性细胞凋亡,在细胞凋亡信号通路中起关键作用[25]。Western blot实验结果显示,SSP1-1在抑制Bcl-2的表达的同时还可以增加Bax的表达,并以剂量依赖的方式激活Caspase-3的表达,进一步证实SSP1-1可诱导HepG2细胞凋亡。

多糖抗肿瘤活性已成为近几年多糖研究领域的热点问题。多糖物质直接抑制肿瘤细胞的途径包括:促进肿瘤细胞凋亡、阻滞肿瘤细胞生长周期等机制发挥作用。此外,多糖还可以增强机体免疫力,作为一种免疫增强剂发挥抑制肿瘤作用。多糖作为一种具有抗肿瘤潜力的功能物质之一,具有较高的研究价值。本文对SSP1-1的相关研究,可为开发一种天然的多糖类抗肿瘤药物或功能性食品提供理论依据。