高效液相色谱-串联质谱法测定芒果中六种链格孢霉毒素残留

张子庚,张爱芝,邢家溧,*,承 海,张书芬,郑睿行,戴贤君

(1.中国计量大学生命科学学院,浙江杭州 310018;2.宁波市食品检验检测研究院,浙江宁波 315048)

芒果富含维生素C和膳食纤维,营养价值高,其产量位居世界水果前列[1],研究表明芒果易受多种病原菌的侵害,特别是链格孢霉属真菌,这是造成芒果腐烂的主要原因。链格孢霉菌属丝状真菌,广泛存在低温潮湿环境之中,是引起水果、蔬菜等农产品腐烂变质的主要微生物之一[2]。链格孢霉毒素是链格孢霉菌分泌的次级代谢产物,对人及动物具有急性、慢性毒性以及“三致”反应等多种危害。目前已鉴明的链格孢霉毒素约有70余种,从结构上区分主要可分为五类[3]:第一类为二苯并吡喃酮类及其衍生物,主要包括链格孢酚(Alternariol,AOH)、交链格孢酚单甲醚(Alternariol mono-methyl ether,AME)和交链孢烯(Altenuene,ALT);第二类为四氨基酸衍生物类,代表毒素为细交链格孢菌酮酸(Tenuazonic acid,TeA)及异细交链孢菌酮酸(iso-tenuazonic acid,iso-TeA);第三类为二萘嵌苯醌类,包括ATX-Ⅰ、ATX-Ⅱ、ATX-Ⅲ等一类衍生物;第四类为丙三羧酸酯类化合物,即AAL毒素,又可分为AAL-TA和AAL-TB两大类;第五类为包括腾毒素(Tentoxin,Ten)在内的其它结构类型。目前关于链格孢霉毒素主要针对柑橘类[4]、番茄类[5]、瓜类[6]、蓝莓浆果[7]以及啤酒[8]等开展的检测研究,而且研究的毒素种类也主要集中在AOH、AME、TeA、ALT、Ten等[9],关于芒果中链格孢霉毒素检测方法和污染现状的研究相对较少,因此建立芒果中多种典型链格孢霉毒素的检测方法,对了解芒果中链格孢霉毒素污染状况具有重要的意义。

随着对链格孢霉毒素毒理学研究的不断深入,对链格孢霉毒素的危害影响逐渐明晰,人们的危害风险防范意识也逐步加强,但迄今为止,国内尚未建立相应的食品卫生标准及检测方法标准。现有研究所涉及的链格孢霉毒素的检测方法主要有薄层色谱法[10]、毛细管电泳法[11]、酶联免疫吸附法[12]、气相色谱法[13]、液相色谱法[14]、气相色谱-串联质谱法[15]和液相色谱-串联质谱法[16]等。薄层色谱法操作过程繁琐,灵敏度低、准确度差;气相色谱法以及气相色谱-串联质谱法无法分离和检测不能气化和热不稳定的物质,由于大部分链格孢霉毒素比较稳定,挥发性差,所以气相色谱法以及气相色谱-串联质谱法很少用于链格孢霉毒素的检测研究;液相色谱-串联质谱法具有快速、精密度高、灵敏度高等优点,与液相色谱法相比,液相色谱-串联质谱法可达到同时定性定量,是目前研究链格孢霉毒素重点采用的方法。目前液相色谱-串联质谱法常采用固相萃取、QuEChERS等前处理方法与之联用[17]。固相萃取操作过程较为繁琐,且部分毒素如AOH回收率低,不适合采用固相萃取进行前处理。而QuEChERS操作简单快速,回收率高,环境污染小[18],但现有文献中QuEChERS方法用于芒果中链格孢霉毒素的检测较少。基于此,本研究拟利用改进的QuEChERS前处理技术结合高效液相色谱-串联质谱法建立快速检测芒果中6种典型链格孢霉毒素AOH、AME、ALT、Ten、TeA和细格菌素(Altenusin,ATS)的方法。针对本文芒果样品基质,考察了带皮芒果与无皮芒果2种基质,分别对液质法的仪器条件种改进的QuEChERS萃取条件进行改进优化,并将该方法用于实际芒果样品检测中，旨在开发一种定性准确、灵敏度高、分析时间短、前处理简单、重现性好的方法,为芒果中链格孢霉毒素污染状况研究提供方法依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

贵妃芒 当地超市,取不同成熟度的芒果(新鲜、稍有腐烂、腐烂严重);AOH、AME、ALT、Ten、TeA、ATS标准品 上海安谱实验科技股份有限公司;乙腈、甲酸、乙酸 色谱纯,德国Merck公司;无水MgSO4、NaCl 国药集团化学试剂有限公司。

ACQUITY UPLC I-CLASS(色谱型号)Waters XeVO TQ-XS(质谱型号)液质联用仪 配有电喷雾离子源(ESI),美国Waters公司;TGL-20M 高速台式冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司;Vortex 3 自动漩涡混合器 德国IKA公司;Milli-Q型超纯水机 电阻率为18.2 MΩ·cm,美国Millipore公司;KS-300EI超声波清洗机 宁波科生设备有限公司;SW22振荡水浴锅 德国Julabo公司;AH-30全自动均质器 睿科仪器有限公司;0.22 μm有机滤膜 北京捷盛依科科技有限公司;ME204E电子天平 实际分度值为0.0001 g,上海梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 仪器条件

1.2.1.1 色谱条件 ACQUITY UPLC BEH C18液相色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱温40 ℃;流动相A为0.1%甲酸溶液,流动相B为乙腈;梯度洗脱程序:0～5.0 min,90%～5% A;5.0～7.0 min,5% A;7.0～7.5 min,5%～90% A;7.5～10.0 min,90% A;0～5.0 min,10%～95% B;5.0～7.0 min,95% B;7.0～7.5 min,95%～10% B;7.5～10.0 min,10% B。此处百分比均为体积比。进样量为5 μL;流速为0.40 mL/min。

1.2.1.2 质谱条件 电喷雾离子源为正离子模式(ESI+);质谱扫描模式为多反应监测模式(MRM);毛细管电压:1.08 kV;锥孔电压:25 V;射频透镜1(RF lens 1)和射频透镜2(RF lens 2)的电压均为15.0 V;离子源温度:150 ℃;脱溶剂温度:600 ℃;脱溶剂气流量:1000 L/h;锥孔反吹气:150 L/h。其他质谱参数见表1,其中“*”为定量离子对。

1.2.2 标准溶液的配制 标准储备液:分别准确称取TeA、AME、AOH、Ten、ALT和ATS标准品0.001 g溶于10 mL乙腈中,配制成100 μg/mL的标准混合液,取100 μg/mL的标准混合液100 μL用乙腈溶解并定容至10 mL,得到1 μg/mL的标准储备液,密封后置于-20 ℃保存。

标准工作液:用乙腈与水(V∶V=1∶1)将标准储备液逐级配制成0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 ng/mL的6种链格孢霉毒素的混合标准溶液。

1.2.3 样品前处理方法 样品前处理方法依据参考文献[19-20]并加以改进:分别称取搅碎匀浆的带皮芒果全果和去皮芒果各5.00 g(精确到0.01 g)于50 mL尖底具塞离心管内,加入3 mL一级水,5 mL 1.5%甲酸-乙腈溶液,2 g无水MgSO4后,涡旋振荡10 min,在9500 r/min下离心5 min,取全部上清液于新的50 mL尖底具塞离心管,加入0.3 g NaCl涡旋3 min,再次在9500 r/min下离心5 min,取上清液500 μL,加500 μL一级水,涡旋混匀,过0.22 μm有机滤膜,上机测定。

2 结果与分析

2.1 色谱与质谱条件的优化

2.1.1 色谱条件优化 液相色谱-串联质谱法常用的流动相体系为水-甲醇、水-乙腈,在正离子采集模式下,甲酸、甲酸铵的引入通常会增强目标物响应、改善目标物峰型,因本实验前处理方法采用甲酸-乙腈为提取剂,并通过水稀释过膜后直接上机分析,为保持一致,本实验重点考察了水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-乙腈、0.1%甲酸+5 mmol甲酸铵溶液-乙腈3种流动相体系。结果表明,因采用正离子采集模式,甲酸的引入会使6种目标链格孢霉毒素响应增强,而甲酸铵引入后目标物响应降低且峰型会出现一定的拖尾,因而选用0.1%甲酸水溶液-乙腈作为流动相体系(图1)。

图1 6种链格孢霉毒素MRM离子质谱图

2.1.2 质谱条件优化 通过流动注射泵连续进样方式进行质谱条件的优化,确定各链格孢霉毒素的锥孔电压、碰撞电压、离子源温度、去溶剂气温度及流量、碰撞气流量及定性定量离子等质谱参数,使每种目标物的离子化效率达到最佳。分别用ESI+和ESI-模式对样品进行全扫描,找出响应值较大的离子为母离子,结果表明:在电喷雾ESI+模式下,6种链格孢霉毒素灵敏度响应值高,TeA、AME、AOH、Ten、ALT和ATS母离子m/z为415.4、273.2、259.2、198.2、293.2和291.2。进一步改变碰撞电压,进行二次质谱扫描,找出信号较强且稳定性较强的子离子(表1)。

表1 质谱参数

2.2 QuEChERS方法萃取条件的优化

QuEChERS方法最早由美国M.Aanstassiads等人建立,用于水果、蔬菜中农药残留检测的前处理方法。其技术核心是在水果、蔬菜的提取液中直接加入除水剂和杂质吸附剂,经离心后直接进行色质联用分析[21]。为提高检测效率,本文借鉴QuEChERS方法,将研究重点放在寻求简单高效的样品前处理上。在优化实验条件的过程中样品基质分别为带皮芒果全果和去皮芒果。

2.2.1 样品量对6种链格孢霉毒素回收率影响的优化 本研究分别考察了1、2、5、8和10 g样品量对6种链格孢霉毒素回收率的影响。具体结果如图2、图3所示,当样品量为1 g时,两种基质中6种链格孢霉毒素回收率均过低;当样品量为2 g时,6种链格孢霉毒素回收率均不高,其中去皮芒果AME、TeA和ATS的回收率仅为35%、60%和27%左右,并且精密度和重复性较差,两种基质中6种链格孢霉毒素的RSD均高达10%以上;当样品量为5、8和10 g时,6种链格孢霉毒素的回收率均高于85%,其中带皮芒果AOH和ALT的回收率高达90%以上,两种基质中6种链格孢霉毒素RSD均较小。从经济环保的角度考虑,最终选择芒果样品基质的取样量为5 g。

图2 带皮芒果中样品量对6种链格孢霉毒素回收率的影响

图3 无皮芒果中样品量对6种链格孢霉毒素回收率的影响

2.2.2 加水量对6种链格孢霉毒素回收率影响的优化 本文课题组曾详细研究过采用QuEChERS-液质联用法快速筛查水果和蔬菜中多种农药的残留检测,发现在水分较少的蔬菜和水果中加入一定量的水,提取效果较好[22]。考虑到芒果甜度高,黏度大,加入除水剂后提取效果不好,所以加入一定量的水,可以增加回收率。本研究详细研究了加水量对提取效率的影响,分别选取了0、1、2、3、4、5 mL的加水量对提取效率的影响,具体结果如图4和图5所示,发现在5 g芒果基质中加入3 mL水的提取效果最好。究其原因可能因为水的加入可以使乙腈更好的浸入到样品内部,从而提高提取效果[23]。

图4 带皮芒果中加水量对6种链格孢霉毒素回收率的影响

图5 去皮芒果中加水量对6种链格孢霉毒素回收率的影响

2.2.3 提取剂选择及其用量对6种链格孢霉毒素回收率影响的优化 TeA是一种酸,因此在对其提取时样品提取液中加入适量酸有利于TeA的提取[24],本实验分别比较了纯乙腈溶液以及浓度为1%、1.5%和2%的乙酸-甲醇溶液、甲酸-乙腈溶液和乙酸-乙腈溶液的提取效果,结果发现:纯乙腈溶液作为提取剂时,回收率较低;乙酸-甲醇溶液作为提取剂时,提取液较为浑浊,且样品回收率较低,最高回收率也只有20%左右;而乙酸-乙腈溶液和甲酸-乙腈溶液提取的提取液的清澈程度和样品回收率远好于乙酸-甲醇溶液以及纯乙腈溶液,其中1.5%甲酸-乙腈溶液效果最佳,如图6所示。

图6 1.5%甲酸-乙腈溶液提取时6种链格孢霉毒素的回收率

本实验进一步考察了1.5%甲酸-乙腈溶液的用量对6种链格孢霉毒素提取效果的影响,分别加入5、10和15 mL的1.5%甲酸-乙腈溶液,实验结果发现加入15 mL提取剂时6种链格孢霉毒素的响应值最大,加入5 mL提取剂时的响应值最小,并且加入15 mL提取液的样品回收率最高,但是10和15 mL所得到的回收率在102%～140%范围内,而5 mL所得到的6种链格孢霉毒素回收率在80%～96%范围内。因此本次研究选取5 mL的1.5%甲酸-乙腈溶液作为提取剂。

2.2.4 无水MgSO4、NaCl用量和吸附剂对6种链格孢霉毒素回收率影响的优化 QuEChERS-液质联用法中经常使用的除水剂主要有MgSO4、Na2SO4和MgCl2等,其中无水MgSO4的除水效果更好[25]。因此本实验分别比较了1、2、3、4和5 g的无水MgSO4用量对6种链格孢霉毒素回收率的影响。实验结果如图7、图8所示,研究表明2 g无水MgSO4相较于其他用量的无水MgSO4所得到的回收率效果最佳,加入3 g以上无水MgSO4时对提取效果有抑制作用。因此确定无水MgSO4的用量为2 g。

图7 无水MgSO4用量对带皮芒果中6种链格孢霉毒素回收率的影响

图8 无水MgSO4用量对去皮芒果中6种链格孢霉毒素回收率的影响

盐析剂的存在可以大大提高萃取效率,本实验考察了盐析剂NaCl 0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 g三种用量对6种链格孢霉毒素回收率的影响。实验结果表明NaCl用量为0.2 g时,6种链格孢霉毒素回收率不高;0.3 g和0.4 g NaCl用量对6种链格孢霉毒素的回收率均达到80%以上;NaCl用量为0.5 g时,回收率在112%～156%范围内。因此选择NaCl用量为0.3 g。本实验又比较了NaCl加入的时间(在离心前加入和离心后)对提取效果的影响,研究发现在离心后取上清液加入0.3 gNaCl,再次离心后提取上清液过膜回收率更高。

当样品被提取盐析出来的时候,难免有芒果样品中的一些成分,如少量蛋白质、油脂以及色素与链格孢霉毒素被一起萃取出来,可能会干扰最终的实验结果。考虑到这6种链格孢霉毒素是平面结构,而石墨化碳黑吸附剂GCB也是平面结构,GCB会吸附链格孢霉毒素[26],所以不考虑GCB。本实验进一步考察了C18、PSA两种吸附剂对6种链格孢霉毒素回收率的影响,发现加入C18后TeA的回收率为40%～50%,加入PSA与不加任何吸附剂对6种链格孢霉毒素的回收率影响不显著,甚至加入PSA后TeA的回收率低于不加任何吸附剂的样品。所以本实验不加入任何吸附剂。

2.2.5 提取方式对6种链格孢霉毒素回收率影响的优化 本实验考察了均质(12000 r/min,5 min)、涡旋振荡(10 min)、超声波(20 min)和水浴振荡(40 ℃,20 min)4种提取方式对6种链格孢霉毒素回收率的影响。实验结果如图9所示,研究表明,采用均质提取时,带皮芒果全果ALT、TeA提取回收率分别为30%、13%,去皮芒果ALT、TeA提取回收率为40%、18%;超声波提取时,TeA、AOH和ALT的回收率均低于40%;水浴振荡提取时,带皮芒果全果TeA的回收率为43%,去皮芒果TeA的回收率仅为7%;在涡旋振荡提取时,样品回收率均高于85%。因此本实验还进一步研究了振荡时间(1、5、10、20、30 min)对6种链格孢霉毒素回收率效果的影响,发现振荡1 min时,6种链格孢霉毒素回收率效果较差;振荡5 min时,TeA和ATS的回收率不高;10、20、30 min振荡对回收率的影响相差不显著,且6种链格孢霉毒素回收率效果均较好。因此,本研究选择涡旋振荡10 min作为提取方式。

图9 4种提取方式对带皮芒果与去皮芒果中6种链格孢霉毒素回收率影响

2.3 基质效应的考察

基质效应是指样品中除目标化合物以外的其它成分对目标化合物响应值的影响[27],是残留检测中普遍存在的现象,通常通过向阴性样品处理液中添加目标化合物与同浓度标准溶液响应的对比,来进行基质效应的考察。本文考察了稀释及小体积进样在减弱或消除基质效应方面的作用。

稀释可以有效的减小样品的基质效应。通常将加标样品稀释,若稀释后的响应值与稀释前相比成比例减小,则说明基本不存在基质效应。若不成相应比例,明显偏大说明存在基质抑制作用,明显偏小存在基质增强作用。本实验采用1.5%甲酸-乙腈溶液进行提取,除水盐析之后,链格孢霉毒素保留在提取液当中,直接上机基质效应严重且有部分溶剂效应,用与提取液同等体积的一级水进行稀释,消除溶剂效应和部分基质效应。用与提取液同等体积的一级水进行稀释,消除溶剂效应和部分基质效应。带皮芒果全果和去皮芒果稀释1倍前后6种链格孢霉毒素响应值如表2所示,通过比较,6种链格孢霉毒素中ALT、Ten、ATS以及带皮芒果全果AME存在基质增强作用,TeA、AOH以及去皮芒果中AME存在基质抑制作用。

表2 带皮芒果全果和去皮芒果稀释1倍前后6种链格孢霉毒素响应值

李红娥[28]发现小体积进样对基质效应有较好的效果,因此本研究采用不同的进样体积(1、3、5 μL)考察对基质效应的影响,结果表明,5 μL进样体积时基质消除不明显,1 μL与3 μL进样体积时基质消除效果相近,但考虑到1 μL进样体积太少,容易导致进样柱不准,实验不好控制,最终选取进样体积3 μL。

2.4 方法学评价

2.4.1 线性关系和检出限 将6种链格孢霉毒素用乙腈配制成1 μg/mL的混合标准储备溶液用乙腈∶水(v∶v=1∶1)逐级配制成0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 ng/mL的标准工作液,供上机使用。

注：ND:未检出。

当6种目标物相关系数均大于0.990,表明各目标物在该浓度范围内具有较好的线性关系。结果如表3所示,6种链格孢霉毒素在0.5～200 ng/mL范围内均有良好的线性关系,采用向实际样品中逐级降低加标浓度的方式进行,经过前处理,上机分析,做9次均能获得较好峰型,以S/N=3作为检出限,6种链格孢霉毒素的检出限在0.6～3.0 μg/kg范围内。

表3 6种链格孢霉毒素的线性范围、线性方程、R2和检出限

2.4.2 加标回收率和精密度 在5 g芒果空白样品中分别加入3个浓度(5、10、20 μg/kg)的6种链格孢霉毒素标准溶液,每个浓度水平重复测定5次。结果如表4所示,6种链格孢霉毒素的回收率在82.5%～110.6%之间,相对标准偏差小于10%。研究表明,本方法对芒果中不同浓度的6种链格孢霉毒素的测定均有较高的回收率和精密度,符合检测要求。

表4 芒果中6种链格孢霉毒素的添加回收率和精密度

2.4.3 实际样品测定 随机选取8个霉变和12个未霉变的芒果样品,采用本方法对芒果样品进行检测。结果如表5所示,12个未霉变的芒果样品中均未检出6种链格孢霉毒素;8个霉变的芒果样品中ALT均未检出。而TeA、AME、AOH、Ten测定值分别在35.61～88.40、5.46～9.62、7.23～22.46、2.68～6.89 μg/kg范围内。有两份芒果样品检测出ATS,分别为9.23和14.29 μg/kg。

表5 霉变芒果样品中6种链格孢霉毒素的毒素含量

3 结论

本文采用5 mL 1.5%甲酸-乙腈溶液提取,2 g无水MgSO4除水,涡旋振荡10 min,9500 r/min下离心5 min,离心后取全部上清液加入0.3 g NaCl盐析,再次离心,最后提取上清液过膜的方法对加入3 mL水的5 g芒果样品进行前处理,通过稀释、小体积进样来减小基质效应,建立了芒果样品中6种链格孢霉毒素QuEChERS前处理技术结合高效液相色谱-串联质谱的快速检测方法。该方法操作简便,高效灵敏,快速准确,满足芒果中链格孢霉毒素的检测要求,可用于实际样品检测。