超声波辅助低共熔溶剂提取野菊花总黄酮的工艺研究

孙 平,董萍萍,董丹华,王 笑,代 龙,高 鹏,*

(1.山东中医药大学药学院,山东济南 250300;2.滨州医学院药学院,山东烟台 264100)

野菊花为菊科植物野菊(ChrysanthemumindicumL.)的干燥头状花序,具有清热解毒,清肝平肝的功效,常用于治疗疮痈疔疖,咽喉肿痛,目赤肿痛和头痛眩晕。经现代研究发现,野菊花中含有丰富的黄酮、有机酸、挥发油、萜类等[1-4]有效成分,其中黄酮是野菊花的主要成分和重要的药效成分,其含量也是用来评价野菊花质量的重要指标,野菊花总黄酮具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗病毒、镇痛等[5-8]作用,用于治疗癌症、心血管疾病、痛风、关节炎[9-12]等。

目前天然药物有效成分主要用甲醇、乙醇等有机溶剂提取,这些溶剂不仅易挥发易燃威胁提取人员安全,而且会污染环境[13]。基于传统溶剂的以上缺点,研究人员已研发出多种绿色溶剂,如离子液体[14](ionic liquid,ILs)、低共熔溶剂[15](deep eutectic solvents,DESs)等。然而最近研究资料表明有些离子液体依然具有较强的毒性并且难以被降解[16]。DES是由氢键受体(hydrogen bond acceptor,HBA)和氢键供体(hydrogen bond donors,HBD)按照一定比例混合而成的低共熔混合物[17],常用的试剂主要为糖、有机酸、尿素、氯化胆碱等[18]。而且DES在天然药物有效成分的提取中比传统的方法更高效,现在已经广泛应用于黄酮[19-20]、酚酸[21]、生物碱[22]、多糖[23]等有效成分的提取工艺研究。为了充分发挥药材药效,减少药材的浪费和有机试剂的污染,本文将结合DES的优点,通过响应面优化试验,研究野菊花总黄酮的最佳提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

野菊花 购自亳州药材市场;芦丁对照品 纯度≥98%,上海源叶生物科技有限公司;氯化胆碱、丙三醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、乙二醇、硝酸铝 上海麦克林生化科技有限公司;乙醇 天津市四通化工厂;亚硝酸钠 天津市博迪化工有限公司;氢氧化钠 天津市富宇精细化工有限公司;葡萄糖 天津市大茂化学试剂厂。

KQ-500E型超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司;DFY-600C高速粉碎机 无锡久平仪器有限公司;XS105DU电子天平 梅特勒-托利多集团;752型紫外可见分光光度计 上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 制备DES溶剂 不同种类DES对黄酮提取效果不同,为筛选不同DES,参考文献[13,24]以氯化胆碱为HBA与不同种的HBD按照一定摩尔比混合,80 ℃搅拌至形成澄清的液体,制得DES。如表1所示。

表1 不同类型的DES溶剂

1.2.2 野菊花总黄酮提取方法 取野菊花,去除杂质后50 ℃减压干燥至恒重,粉碎备用。称量处理后的野菊花粉末1 g,加入一定料液比的不同含水量的DES,在一定温度下,超声处理(功率450 W,频率40 KHz)一定时间,之后以5000 r/min离心10 min取得上清液,得总黄酮提取液。

1.2.3 单因素实验 采用1.2.2方法提取野菊花总黄酮,以DES-6为提取溶剂,考察不同的提取条件,测定总黄酮得率。单因素实验设计如表2。

表2 单因素实验表

1.2.4 响应面试验 在单因素实验的基础上,选择3水平4因素的Box-Behnken设计试验优化提取条件,以总黄酮得率为响应值,用Design Expert 8.0进行试验数据分析,因素水平表见表3。

表3 响应面因素水平设计

1.2.5 总黄酮得率的测定 采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定野菊花总黄酮含量,精密称定20 mg芦丁对照品,用60%乙醇配置成0.20 mg/mL的芦丁标准品溶液。准确吸取0.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mL的标准品溶液于25 mL量瓶中,加入1.0 mL 5%亚硝酸钠溶液、1.0 mL 10%硝酸铝溶液,振荡均匀后放置5 min,再加10.0 mL 4%氢氧化钠溶液,用60%乙醇加至刻度线,振荡均匀后放置15 min。在510 nm波长下测吸光度,根据芦丁浓度和吸光度绘制标准曲线。样品总黄酮测定为:取样品溶液适量至25 mL容量瓶中,后续操作按照标准曲线方法进行,总黄酮得率计算公式如下:

式中:W表示总黄酮得率,mg/g;c表示根据吸光度值计算出的溶液质量浓度,mg/mL;V0表示定容后的提取液体积,mL;V1表示样品总体积,mL;V2表示测定用体积,mL;m表示药材取样量,g。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制

根据芦丁标准品浓度和吸光度的测定结果绘制标准曲线如图1,线性回归方程为Y=11.99X+0.0045,R2=0.9992,其中Y为吸光度,X为芦丁标准品浓度。

图1 芦丁标准曲线

2.2 不同类型DES提取结果

不同类型的DES具有不同的溶解性、黏性、密度、导电性等物理化学性质,这对目标成分的提取具有重要的影响效果[25]。本研究以氯化胆碱为HBA,选择不同HBD,加热搅拌制备DES。本研究通过比较不同类型HBD、不同摩尔比的DES对得率的影响,制备10种不同DES,结果如图2显示,总黄酮得率大小为DES-6>DES-4>DES-5>DES-2>其他EDS,其中DES-6总黄酮得率可达53.85 mg/g。根据结果推测,可能由于1,4-丁二醇与氯化胆碱制备的DES与野菊花总黄酮极性相似利于溶出,而且具有较低的黏性和表面张力,对细胞具有更好的渗透性。相对比1,3-丁二醇制备的DES，推测羟基在多元醇的位置也会影响DES的黏性和极性,从而影响提取效果。同一种HBD,摩尔比1∶3的DES比摩尔比1∶2的DES具有更低的黏性和表面张力,更易于提取溶剂的渗透和促进野菊花总黄酮溶出。因此最终确定选择DES-6(1,4-丁二醇为HBD,摩尔比1∶3)为最佳类型的提取溶剂。

图2 不同DESs对总黄酮得率的影响

2.3 单因素实验结果

2.3.1 不同含水量的DES对得率的影响 含水量会改变DES的物理化学性质,尤其对黏性和极性有重要影响[26],含水量增加会减弱DES的氢键结合,导致黏性迅速降低。增加水的加入量也会改变DES的极性,使其极性更加接近水,DES极性不同对成分提取效果不同。通过选择不同含水量的DES,比较其总黄酮得率,如图3所示。结果表明当含水量为30%时,总黄酮得率最高为54.28 mg/g,增加含水量后总黄酮得率明显下降。可能由于含水量增加导致DES极性增加,因而不利于黄酮溶解。

图3 不同含水量对总黄酮得率的影响

2.3.2 不同料液比对得率的影响 料液比对有效成分的传导具有重要作用,增大溶剂用量会使样品周围成分浓度下降,有利于成分由细胞内部向溶剂中扩散,但过度增加溶剂不仅造成浪费,而且会增加非目标成分溶出,影响提取效果增加纯化难度。根据图4可知,当料液比增加到1∶25 g/mL时,总黄酮得率逐渐升高,之后增加料液比,总黄酮得率呈下降状态,因此选择料液比为1∶25 g/mL,此时总黄酮得率可达58.35 mg/g。

图4 不同料液比对总黄酮得率的影响

2.3.3 不同超声时间对得率的影响 超声提取的机械作用和空化现象增加了溶剂的穿透力,有利于有效成分溶出,缩短了提取时间。由图5可知当超声时间20～40 min时,总黄酮得率逐渐增加至60.04 mg/g,之后呈明显下降状态。随着超声时间增加,得率明显下降,可能由于超声波的机械效应或温热效应导致某些黄酮成分分解[27],因此选择提取时间为40 min。

图5 不同超声时间对总黄酮得率的影响

2.3.4 不同超声温度对得率的影响 研究表明升高温度降低DES的黏度、增加扩散系数等有利于成分溶出[28]。而且升高温度会加快分子运动,使有效成分加速扩散,但过高温度会破坏有效成分,不利于提取。通过图6可知,当超声温度升高至70 ℃时,总黄酮得率增加至61.52 mg/g,但温度高于70 ℃得率呈下降状态,因此选择提取温度为70 ℃。

图6 不同超声时间对总黄酮得率的影响

2.4 响应面试验结果

2.4.1 统计分析和模型拟合 在单因素实验结果的基础上,采用4因素3水平的BBD响应面试验。试验设计与实验结果见表4,方差分析结果见表5。

表5 回归模型方差分析

表4 响应面实验设计与结果

根据P值的大小可以看出模型一次项A、C、D对响应值有极显著影响(P<0.01),B值影响不显著(P>0.05);模型交互项BC、BD、CD影响极显著(P<0.01),AB影响显著(P<0.05),AC、AD影响不显著(P>0.05);二次项A2、B2、C2、D2影响极显著(P<0.01)。根据F值可以看出,对总黄酮得率影响因素含水量(A)>超声时间(C)>超声温度(D)>料液比(B)。

2.4.2 响应面分析 结果分析中,响应面3D曲线图的曲面倾斜度越高,两因素的交互作用越显著。根据图7可明显看出,交互项BC、BD、CD曲面有较大的倾斜度,说明两因素的交互项对野菊花总黄酮的得率影响较大(P<0.01)。

图7 各因素交互作用的响应面图

2.4.3 结果验证与方法比较 根据拟合方程与模型优化提取因素,得到最佳提取条件为含水量28.1%,料液比1∶25.4 g/mL,超声时间38.4 min,超声温度64.9 ℃,预测得率为62.08 mg/g。为了方便实验,将提取参数修改为含水量28%,料液比1∶25 g/mL,超声时间38 min,超声温度65 ℃。为验证预测得率结果,在最佳提取条件下进行3次平行试验,得到总黄酮得率为(62.16±1.62) mg/g。与预测值62.08 mg/g 结果相近,表明该模型可用于野菊花总黄酮提取。与经典回流提取方法[29]比较,结果经典回流提取总黄酮得率为50.12 mg/g。可见采用DES溶剂提取野菊花总黄酮显著提高了总黄酮的得率。

3 结论

本研究探讨了一种以DES为提取溶剂,从野菊花中提取总黄酮的方法。通过氯化胆碱和1,4-丁二醇按照摩尔比1∶3混合制备新型DES溶剂,以野菊花总黄酮得率为指标在单因素试验的基础上结合响应面试验优化最佳提取条件,最佳提取条件为:DES-6含水量28%,料液比1∶25 g/mL,超声时间38 min,超声温度65 ℃,总黄酮得率为62.16 mg/g。通过验证实验表明模型预测可靠,可用于野菊花总黄酮提取。与经典回流法比较,DES不仅毒性较小,而且得率更高,为野菊花总黄酮提取提供一种新思路。

尽管DES已经用于多种天然药物提取工艺研究,但目前仅存在于实验室研究水平,若应用于工业天然药物成分生产还需要进一步研究有效成分的分离精制、DES的回收利用、提取物的生物活性以及制备成本和效率等问题。