基于低共熔溶剂法超声辅助蒸馏提取胡椒叶精油的工艺优化及其GC-MS分析

陈长锴,樊志国,赵凤翔,吴颍颍,施瑞城,*

(1.三沙南海美源岛生物科技有限公司,海南三沙 573199;2.海南大学食品科学与工程学院,海南海口 570100)

胡椒(PipernigrumL.)是胡椒科胡椒属多年生常绿开花藤本植物,是海南的一项特色农产品,占全国胡椒总产量的90%以上。在传统医学领域,胡椒是应用的非常广泛的药物[1]。泰国的当地人在市场购买胡椒的叶和茎用来治疗某些疾病[2]。由于精油具有抗氧化[3]、抑菌[4]等活性,可用于食品的保鲜[5]和化妆品工业中[6]。此外精油的化学成分非常丰富,具有一定的保健功效,如抗炎[7]、活血化瘀等。

目前,对胡椒精油的研究主要集中在胡椒叶和胡椒果上。张水平等[8]采用水蒸气蒸馏法提取胡椒叶精油,其精油得率为1.25%。杜丽君等[9]采用溶剂萃取法提取胡椒木叶片精油,其精油得率为0.405%。谢敏华[10]采用超临界CO2萃取黑胡椒精油得率为7.02%。王颖等[11]采用超声微波协同技术提取白胡椒精油,发现白胡椒果精油得率相对较高为3.80%。然而水蒸气蒸馏法[12-13]、溶剂浸提法[14-15]、超临界CO2萃取法[16]等传统方法的成本效益高和过长的提取时间,因此,寻找一种成本低、提取时间短、绿色环保的提取方法很有必要。

Abbott等[17]发现了一种由一定摩尔比的氢键受体(hydrogen bond acceptor,HBA)(如季铵盐)和氢键供体(hydrogen bond donor,HBD)(如羧酸、多元醇)组成的新型、绿色和低熔点的离子溶剂[18-20]。低共熔溶剂(deep eutectic solvents,DES)具有良好的热稳定性和低挥发性,特别是具有易降解性、制备简单、成本廉价等优点。本文以低共熔溶剂作为提取剂,采用超声辅助水蒸气蒸馏的方法提取胡椒叶精油,并用响应面法对胡椒叶精油提取工艺影响较大的三个因素即液料比、超声功率和蒸馏时间进行优化,以便获取最佳的提取条件,并采用气相色谱-质谱法分析精油成分,以期为精油的提取方法提供一条新思路,拓展DES的应用范围。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

胡椒叶 海南省定安县黄竹镇;正己烷 色谱纯,购自美国Mreda公司;氯化胆碱、乙二醇、乳酸、尿素、葡萄糖、甘油、正己烷、无水硫酸钠 均购自美国阿拉丁试剂有限公司;其他试剂 均为国产分析纯。

KH-1500DB型单槽式数控超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司;DFY-200C高速万能粉碎机 上海皓庄仪器有限公司;YHG-9050A台式电热恒温鼓风干燥箱 上海姚氏仪器设备有限公司;AL-IC系列分析天平 上海精密仪器仪表有限公司;JB挥发油测定器 常州普天仪器制造有限公司;AMD10气相色谱质谱联用仪 常州磐诺仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 新鲜胡椒叶清洗干净,在60 ℃的电热鼓风干燥箱中烘干至恒定重量,粉碎并过筛(50目)置于干燥器中干燥备用。

根据文献报道,制备DES、HBA(氯化胆碱)和HBD在80 ℃的恒温水浴锅中混合加热搅拌0.5～2.0 h,直至形成均匀无色透明的液体。按照表1制备不同类型的DES。

表1 不同类型DES

1.2.2 胡椒叶精油提取工艺 准确称取30 g的胡椒叶粉末,加入一定量的DES置于500 mL圆底烧瓶中,按液料比加入蒸馏水进行超声辅助处理30 min,然后利用挥发油提取器水蒸气蒸馏提取胡椒叶精油,分液之后加无水硫酸钠干燥,称量并计算胡椒叶精油得率。

胡椒叶精油得率(%)=(提取精油的重量/干胡椒叶粉末重量)×100

1.2.3 不同类型DES对精油得率的影响 按照表1所示,胡椒叶粉末经过DES-1、DES-2、DES-3、DES-4、DES-5进行提取,根据胡椒叶精油得率来分析5种DES对精油的提取效果,选择提取效果最好的DES进行后续的单因素实验。

1.2.4 单因素实验 采用1.2.2的方法提取胡椒叶精油,提取条件为:保持超声功率300 W、蒸馏时间50 min的因素不变,比较不同液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1 mL/g)对胡椒叶精油得率的影响;保持液料比10∶1 mL/g,蒸馏时间50 min的因素不变,比较不同超声功率(100、200、300、400、500 W)对胡椒叶精油得率的影响;保持液料比10∶1 mL/g,超声功率300 W的因素不变,比较不同蒸馏时间(30、40、50、60、70 min)对胡椒叶精油得率的影响。根据单因素实验来探究各因素变量对胡椒叶精油得率的影响。

1.2.5 BBD优化胡椒叶精油提取条件 由1.2.4单因素实验的结果,以液料比(A)、超声功率(B)、蒸馏时间(C)为自变量,以胡椒叶精油得率(Y)为响应值,根据BBD设计实验原理,设计三因素三水平的响应面进行分析实验与统计分析。试验设计因素与水平如见表2所示。

表2 响应面设计实验因素与水平

1.2.6 GC-MS分析胡椒叶精油成分 GC条件:BR-5 ms毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);升温程序:初始温度为60 ℃,以1.5 ℃/min的速度升至185 ℃,保持1 min,然后以9 ℃/min的速度升至275 ℃,保持2 min;进样量0.5 μL;压力2.4 kPa,载气为He,流速1 mL/min,分流比40∶1。

MS条件:EI电离源,能量70 eV;离子源温度230 ℃,四极杆温度150 ℃,接口温度250 ℃,质量扫描范围m/z 35～500。

1.3 数据处理

所有实验重复3次。使用SPSS 16.0统计软件对单因素实验数据进行单因素方差统计分析与显著性检验,Design-Expert响应面软件对胡椒叶精油提取的相关因素数据进行分析与响应面优化,采用Origin 8.5软件作响应面图。

2 结果与分析

2.1 DES类型的筛选

根据图1可以看出5种低共熔溶剂对精油得率的影响中,DES-4(氯化胆碱-尿素)对胡椒叶精油提取效果最佳,其精油得率为1.312%±0.018%。Kumar等[21]研究表明,一些DES可以溶解纤维素,用于植物组织的预处理能增强细胞内化合物的释放。根据实验结果可知,氢键供体为酰胺类的低共熔溶剂(DES-4)对精油的提取得率优于氢键供体为多元醇类(DES-1、DES-2)、羧酸类(DES-3、DES-5)的低共熔溶剂。季铵盐类(氯化胆碱)低共熔溶剂对纤维素的溶解机理是季铵盐阳离子与纤维素羟基上的氧原子发生反应从而形成新的氢键,这符合纤维素羟基基团上的氢、氧原子参与的电子接受和提供机理[22-23],乙酸根阴离子与己内酰胺的作用能为半纤维素的溶解提供更多活性位点,而季铵盐与酰胺类物质间的氢键结构使纤维素由致密有序结构向毛糙无序结构转变[24],对木质素有着较强的溶解能力。故选择氯化胆碱-尿素(DES-4)低共熔溶剂进行后续实验。

图1 不同类型DES对精油得率的影响

2.2 单因素实验

2.2.1 液料比对精油得率的影响 根据图2可以分析出,胡椒叶精油得率在液料比10∶1 mL/g之前时是随液料比的增加而提高,胡椒叶精油得率在液料比为10∶1 mL/g时达到最大值,之后胡椒叶精油得率随液料比的增加而区域缓慢,稍有降低。原因是当液料比过小即胡椒叶粉末中蒸馏水过少时,由于蒸馏水不能充分渗入胡椒叶粉末中,导致精油不易溢出,也有可能蒸馏水过少致使胡椒叶粉末局部受热而降低了胡椒叶精油得率;当液料比过大即胡椒叶粉末中蒸馏水过多时,由于少部分胡椒叶精油溶解在水中从而降低其得率,同时考虑时间成本和能耗[25-26]。所以,液料比应控制在10∶1 mL/g左右较为合适。

图2 液料比对精油得率的影响

2.2.2 超声功率对精油得率的影响 根据图3可以分析出,胡椒叶精油得率在超声功率为300 W之前时是随着超声功率的增加而随之提高,这是由于超声功率过低时,空化作用较弱,使得液体内局部的拉应力不够,精油不易溢出,当超声功率增大时,空化作用会随超声功率的增大而增强,加快分子扩散速度,致使精油的溢出,从而提高精油得率;胡椒叶精油得率在超声功率为300 W之后，随着超声功率的增加而降低,原因在于超声功率过大时,空化作用大幅度增强,减少了物料停留在超声场中的时间,降低了水分向植物组织内渗透的几率,这与李雪[27]在用超声辅助提取紫苏精油的研究结果类似。因此,超声功率应控制在300 W左右较为合理。

图3 超声功率对精油得率的影响

2.2.3 蒸馏时间对精油得率的影响 根据图4的可以分析得到,胡椒叶精油得率在蒸馏时间到达50 min之前时是随蒸馏时间的增加而提高,这是由于蒸馏时间比较短,精油溢出不彻底,故精油得率不高;精油得率在蒸馏时间为50 min时达到最大值。但蒸馏时间超过50 min之后,胡椒叶精油得率反而有所降低,可能由于部分精油的挥发损失所致,在马玉花等[28]研究杏仁精油提取工艺中有着类似的发现,同时考虑时间成本和能量的消耗,所以蒸馏时间应控制在50 min左右比较合适。

图4 蒸馏时间对精油得率的影响

2.3 响应面法优化胡椒叶精油提取条件试验结果

2.3.1 响应面优化实验设计结果及方差分析 根据单因素实验结果,把液料比(A)、超声功率(B)、蒸馏时间(C)作为优化参数,以胡椒叶精油得率(Y)为响应值,根据BBD设计原理进行响应面分析,结果如表3所示。

表3 响应面实验设计与结果

利用Design-Expert软件对所得数据进行回归分析与方差分析,由此可以得到Y(精油得率)与液料比(A)、超声功率(B)、蒸馏时间(C)的二次回归方程为:

Y=1.32+0.082A+0.13B+0.034C+0.012AB+0.044AC+0.036BC-0.07A2-0.17B2-0.12C2。

表4 回归模型及方差分析

2.3.2 响应面图分析 通过Design expert软件对胡椒叶精油进行响应面方差分析以及回归方程模型的建立,然后利用Origin8.0软件做出相应的响应曲面图,如图5～图7所示。

图5 液料比和超声功率对胡椒叶精油得率交互影响的响应面图

由图5～图7可分析各因素对胡椒叶精油的率的影响以及各因素之间的相互作用,保持液料比(A)、超声功率(B)、蒸馏时间(C)任意一个因素为零水平,另外两个因素间的交互作用及对胡椒叶精油得率的影响。由图5～图7结果可知,从响应面的走势及坡度来看,图6～图7曲面走势陡峭,说明液料比和蒸馏时间、超声功率和蒸馏时间之间交互效应较显著,与方差分析结果一致。从等高线的形状及疏密程度看,图6～图7等高线形状都呈现椭圆形且曲线较密集,说明液料比和蒸馏时间、超声功率和蒸馏时间之间互作效应较强,其互作效应对响应值的影响显著。

图6 液料比和蒸馏时间对胡椒叶精油得率交互影响的响应面图

图7 超声功率和蒸馏时间对胡椒叶精油得率交互影响的响应面图

2.4 最佳条件与验证实验

由Design expert软件分析得到回归方程,回归模型预测提取胡椒叶精油的最佳优化条件为:液料比13.63∶1 mL/g,超声功率344.11 W,蒸馏时间53.39 min,精油得率最大达到1.387%。鉴于工艺流程的可操作性和便利性,修正后的胡椒叶精油提取的工艺参数为:液料比14∶1 mL/g,超声功率300 W,提取时间53 min。根据修正后的工艺参数,重复3次实验来验证胡椒叶提取精油得率,由此得到胡椒叶精油实际的得率为1.380%±0.018%,与响应面模型理论值相对误差约为0.50%(误差在允许范围之内),说明实际情况与回归模型预测情况拟合较好。利用响应面法对基于DES的超声辅助水蒸气蒸馏提取胡椒叶精油的优化工艺,其结果准确可靠。

利用DES来提取胡椒叶精油与传统方法相比,精油的色泽、性状等外观没有明显区别,在常温下为淡蓝色透明的油状液体,伴随着浓厚的胡椒叶气味。由表5可知,新方法跟水蒸气蒸馏法和超声辅助水蒸馏蒸馏法相比,胡椒叶精油得率分别提高了14.33%、5.18%。其结果跟张水平等[8]研究胡椒果与胡椒叶精油化学成分分析的结果相似,说明实验结果符合预期。

表5 不同提取方法对精油得率的影响

2.5 胡椒叶精油GC-MS成分分析

从胡椒叶精油中共分离检测到34种挥发性化学成分,利用质谱信息与标准谱库NIST08分别对各色谱峰进行初步检索及相关文献参考定性,确认挥发性物质名称,其分析结果见表6。由表6可知,其中烯烃类18个,醇类11个,醛类1个,酚类1个,酯类1个,其他化合物2个,主要成分包括:δ-榄香烯(19.75%)、α-荜澄茄油烯(9.17%)、石竹烯(8.97%)、α-古芸烯(6.12%)、β-榄香烯(5.13%),其中烯烃类化合物含量最为丰富,占精油成分73.0%。张水平等[8]的研究中胡椒叶精油的主要成分为δ-榄香烯,其含量占总物质成分的38.54%,而在本研究中δ-榄香烯的含量为19.75%,这可能是跟胡椒叶的品种类型、地理环境、处理方式以及提取条件等因素差异所导致。本实验提取的胡椒叶精油中的δ-榄香烯的相对较高,根据相关的文献记载所知,δ-榄香烯具有显著的抗肿瘤作用[29],其中β-榄香烯属于国家二类非细胞毒性肿瘤药物,使胡椒叶具有很高的开发和利用价值。

表6 胡椒叶精油化学组成成分

3 结论

本研究利用新型的低共熔溶剂来提取胡椒叶精油,通过单因素实验和响应面分析法优化了胡椒叶精油提取的工艺条件,以液料比、超声功率和蒸馏时间为自因素,以胡椒叶精油得率为响应值进行胡椒叶精油的响应面回归模型分析,修正提取胡椒叶精油工艺优化条件后为:液料比14∶1 mL/g、超声功率300 W、提取时间53 min,由此得到胡椒叶精油实际得率为1.380%±0.018%,该回归模型预测值与实际值吻合较好,进一步验证了该模型的可靠性。通过基于DES超声辅助水蒸气蒸馏胡椒叶精油的工艺,精油得率比水蒸气蒸馏精油得率提高了14.33%,比超声辅助水蒸气蒸馏精油得率提高了5.18%。由此说明,以氯化胆碱-尿素作为低共熔溶剂提取胡椒叶精油的方法是可行的。通过GC-MS分析鉴定出34种化合物,其主要成分为δ-榄香烯(19.75%)、α-荜澄茄油烯(9.17%)、石竹烯(8.97%)、α-古芸烯(6.12%)、β-榄香烯(5.13%),其中δ-榄香烯具有很好的研究价值。本文为胡椒叶精油的开发利用提供了一种新的提取方法,同时拓宽了DES应用领域。胡椒叶的综合利用也有利于胡椒叶精油在食品、药品及化妆品行业的普及。