生料醋醅中优势醋酸菌的筛选及其产酸特性

李 阳,张 倩,杨 埔,柳青山,张一中,张丽珍,*

(1.山西大学生命科学学院,山西太原 030006;2.山西省农业科学院高粱研究所,山西晋中 030600)

醋是日常生活中一种常见的调味品,随着酿醋工艺的发展和对醋功能的深入研究,食醋除了可以增添滋味、提供人体所必须的氨基酸外,还含有丰富的多酚[1]、黄酮[2]等物质,在抗癌[3]、心血管疾病[4]的预防方面也有很大作用。一般食醋的酿造过程主要是将粮食蒸煮后,加入发酵剂进行发酵[5],生料醋与传统发酵最大的区别就是原料不需要蒸煮[6],直接进行发酵,微生物种类更多[7],因此口感更加醇厚柔和[8]。风味口感是判断食醋质量的主要指标,对于生料醋而言,有机酸是其酸味的主要来源[9],是影响生料醋质量的重要因素。

目前多数的研究集中于山西老陈醋、镇江香醋的菌群多样性分析[10-11]、成分含量检测[12-13],结果表明醋醅中乳杆菌属(Lactobacillus)和醋杆菌属(Acetobacter)占有较大组成,醋酸菌中巴氏醋杆菌(Acetobacterpasteurianus)是发酵的关键菌株;也有学者[14]研究了固态酿造食醋中有机酸的种类,发现其中的有机酸除了乙酸外还有乳酸、琥珀酸。王兴华等[15]检测了老陈醋中醋酸和乳酸的含量,分别为1.51、1.2 (g/100 mL),对于生料醋的研究则局限于探讨其发展前景[16]、分析其生产工艺[17],相比之下,生料醋中有机酸种类与含量的分析存在很大空白。为了更加深入的了解生料醋产酸菌的发酵特性,本试验对生料醋中的菌株进行筛选、分离纯化及鉴定,筛出产酸菌种,研究其生长情况,并分析其有机酸的种类与含量,对于生料醋品质的把控有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

生料醋醅 于山西长治某生料醋厂采集,当日置于车载冰箱运回实验室,-80 ℃超低温冰箱保藏备用;无水葡萄糖 山东西亚化学工业有限公司;硫酸镁 天津市北辰方正试剂厂;酵母浸粉,蛋白胨 北京奥博星生物技术有限责任公司;琼脂粉 北京索莱宝科技有限公司;无水乙醇(分析纯) 天津欧博凯化工有限公司;磷酸二氢钾(色谱纯) 北京精求化工厂;乳酸,乙酸,琥珀酸,柠檬酸,草酸(纯度>99%) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

AD-88大容量全温气浴振荡器常 州国宇仪器制造有限公司;YXQ-LS-50SII立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;Agilent 1260Infinity II液相色谱仪 费尔伯恩精密仪器(上海)有限公司;ME204电子天平 梅特勒托利多仪器(上海)有限公司;KQ5200E型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;BD-30自动菌落计数器 北京启航博达科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基 分离纯化培养基:酵母粉3 g,蛋白胨4 g,葡萄糖10 g,琼脂12 g,4000 μL 1.6%溴甲酚紫,水1000 mL,调节pH至6.0～6.2,在0.1 MPa、121 ℃条件下蒸汽灭菌27 min;

发酵培养基:葡萄糖10 g,酵母粉10 g,硫酸镁0.5 g,磷酸二氢钾0.5 g,琼脂12 g,水1000 mL,灭菌后加入4%无水乙醇,于0.1 MPa、121 ℃条件下蒸汽灭菌27 min。

1.2.2 产酸菌的分离纯化 分别从发酵了12、18、24、30、36 d的醋醅中采样约10 g,加入装有50 mL蒸馏水的锥形瓶中,于28 ℃全温气浴振荡器振荡培养30 min,设置3个重复;将样品稀释1000倍后,吸取50 μL涂布至分离纯化培养基,以溴甲酚紫为指示剂。菌落长出后,根据菌落周围是否变成黄色来判断是否产酸;挑取单个生长的产酸菌落,多次分离纯化,直至长出单一菌落,最后挑取菌落在液体培养基扩大培养后,加入到甘油培养基中于-20 ℃的冰箱保存备用。

1.2.3 产酸菌的鉴定

1.2.3.1 形态学鉴定 挑取纯化的菌株到滴有无菌水的洁净载玻片上,将菌均匀涂抹自然干燥后,用草酸铵结晶紫染液染色约1 min,用水冲洗、干燥,进行光学显微镜观察。

1.2.3.2 生物学鉴定 采用CTAB法[18-20]提取产酸菌总DNA,16S rDNA的基因扩增参照文献[21-22]。

在1%的琼脂糖凝胶上对PCR扩增产物进行电泳,若形成清晰条带,则将扩增产物委托金唯智生物技术公司进行测序。在NCBI数据库中进行BLAST序列比对,找到与目标菌株同源性较高的模式菌株后,利用MEGA6.0进行序列分析并构建系统发育树。

1.2.4 优势产酸菌筛选

1.2.4.1 温度耐受性 共设置五个温度梯度,分别是28、37、42、47、52 ℃。将筛选出的菌种接种到分离纯化培养基上,全部置于28 ℃培养箱中,培养3～5 d后,菌落长出且培养基颜色变黄再转接新的培养基平板置于37 ℃的培养箱中,照此方法重复42、47、52 ℃,每种温度培养3 d左右观察菌株长出与否以及培养基是否变黄色。

1.2.4.2 过氧化情况 在筛选产酸菌的过程中,有的菌种会出现过氧化的现象。在固体培养基中加入溴甲酚紫,培养基变成黄色,说明该菌可以产酸,培养基再由黄色变成紫色,说明该菌可以分解乙酸,有过氧化乙酸的能力。接菌后28 ℃培养3～5 d,待菌株长出每天观察培养基的颜色变化情况,以培养基能否变成紫色判断该菌是否可以过氧化乙酸。

1.2.5 优势产酸菌巴氏醋杆菌L4特性研究

1.2.5.1 生长曲线的测定 将筛选出的巴氏醋杆菌接种至液态发酵培养基活化两次,于28 ℃、180 r/min的全温气浴振荡器中过夜振荡培养,按2%接种量加入到发酵培养基中,设置3个重复,置于振荡器中培养至132 h,从0 h开始,每隔4 h采一次样,采至36 h,再每8 h采样一次,至84 h,后间隔12 h采样一次,至132 h;将样品分别稀释到10-4、10-5,各吸取50 μL均匀涂布至培养基平板,于28 ℃的恒温培养箱培养,长出菌落后计数。

1.2.5.2 产酸特性 将接种了2%种子培养液的液态发酵培养基置于28 ℃、180 r/min的全温气浴振荡器中培养至116 h,设置3个重复,从0 h开始采样,每隔8 h采样一次至80 h,后间隔12 h采样一次至116 h,将样品用0.45 μm滤膜过滤后通过高效液相色谱仪测定产酸类型和产酸量。

1.2.6 有机酸的检测 产酸高效液相色谱检测条件参照杨钰昆等的测定方法[23]。色谱柱:Supersil AQ-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:甲醇∶0.02 mol/L磷酸二氢钾体积比为3∶97,磷酸调pH至2.7;流速:1.00 mL/min;柱温:30 ℃;检测波长:210 nm;进样量:10 μL。

有机酸混标液:分别称取草酸、乳酸、乙酸各0.01 g,柠檬酸、琥珀酸各0.02 g,定容至10 mL,4 ℃冰箱中保存备用。以不同的进样质量浓度为横坐标,对应的不同峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,得到回归方程和相关系数。

1.3 数据统计

实验数据均重复3次,由Excel 2003软件计算制作图表和SPSS 20软件分析。

2 结果与分析

2.1 产酸菌的分离纯化

添加有溴甲酚紫的培养基平板在酸性条件下会变成黄色,颜色变化明显,因此溴甲酚紫可用作产酸指示剂,该方法于1992正式建立[24]。此法简单易操作,便于产酸菌的初步筛选。

将生料醋醅的菌悬液稀释涂布,于28 ℃培养2～3 d后,菌株产酸使平板变成黄色,如图1所示。挑选出5株黄色明显,形态完整的单菌落进行下一步研究,并编号为L1、L3、L4、L7、L11。

图1 溴甲酚紫显色平板上的产酸菌菌落形态

2.2 产酸菌的鉴定结果

菌株在分离纯化培养基上的形态及显微镜观察结果如图2所示,菌落形态为圆形、中部隆起、颜色为乳白色、边缘呈钝齿或弥漫状、表面光滑,经革兰氏染色后,光学显微镜下观察到短棒状的菌体,单个或多个排列。

图2 菌落形态图和显微观察图(100×)

平板初筛结果及菌株形态观察不能准确将菌株鉴定到种,需结合分子生物学鉴定。

将L1、L3、L4、L7、L11等5株产酸菌的16S rDNA扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳,如图3所示。5株产酸菌的PCR扩增基因大小约为1500 bp,条带清晰,可进行下一步测序。

图3 产酸菌16S rDNA的扩增产物电泳图

利用NCBI数据库进行BLAST比对,测得的DNA序列与巴氏醋杆菌相似度非常高,达到了97%以上。16S rDNA序列的相似度超过97%可确定为同一属[25]。利用MEGA6.0构建Neighbor Joining系统进化树,结果如图4,可知5株产酸菌均属同一种。综合形态学鉴定产酸定性结果,可确定所得5株菌株为巴氏醋杆菌Acetobacterpasteurianus。

图4 产酸菌的系统发育树

2.3 优势产酸菌的筛选结果

2.3.1 温度的耐受性结果 共设置28、37、42、47、52 ℃五个温度梯度,根据有无菌落长出且培养基颜色是否变黄为判断,5个单菌落对不同温度的耐受性结果见表1。

表1 菌株对不同温度的耐受性情况

由表1可知,五株产酸菌在28、37 ℃均可正常生长,L3在42 ℃时已不能存活,L1、L4、L7、L11在47 ℃高温均长势良好,L4对温度的耐受性最好,在52 ℃仍可生长,且L4的产酸速度较快。

2.3.2 产酸菌的过氧化特性结果 将5个单菌落培养基平板的培养时间延长到14 d,菌株出现的过氧化乙酸会使黄色的培养基变成紫色,5个菌株的过氧化情况有所不同,结果如表2所示。

由表2可知,L1、L3、L7、L11在发酵过程中均有不同程度的过氧化乙酸,其中L1、L3过氧化较少且慢,L7、L11过氧化较多且快,L4在发酵过程中没有过氧化情况的出现。

表2 菌株的过氧化乙酸情况

综合5株巴氏醋杆菌对温度的耐受性及过氧化情况,挑选出产酸最快,耐52 ℃高温,无过氧化的L4号菌株进行下一步发酵特性研究。

2.4 优势产酸菌巴氏醋杆菌L4特性研究

2.4.1 巴氏醋杆菌L4的生长曲线 由巴氏醋杆菌菌落数变化曲线(图5)可知,在0～4 h之间菌落处于延滞期,因代谢系统适应新环境的需要,菌落数目没有增加,8～12 h菌落数呈指数增长;12～16 h菌落数趋于稳定;16 h菌落数达到了最大值为2.0×108CFU/mL,在巴氏醋杆菌培养生长初期培养基营养成分丰富,因而菌株繁殖快;16 h后巴氏醋杆菌进入衰亡期,在20～132 h菌落个数没有太大的波动,可能是由于菌落个数保持一段高密度生长后所需要的营养物质消耗高,不能维持下去而导致一些菌落淘汰。

图5 巴氏醋杆菌菌落数变化曲线

2.4.2 HPLC测酸方法的确定 按照1.2.6所述方法对五种标准有机酸进行线性回归分析(表3),结果表明所得标准曲线的相关系数均大于0.998,表明线性关系良好,该方法可以用于5种有机酸的测定。

表3 有机酸的回归方程、相关系数、线性范围及最低检出限

五种有机酸标准品色谱图如图6所示:

图6 有机酸混合标准溶液色谱图

由图7可知,生料醋醅在发酵过程中除了生成草酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸五种有机酸外,还有几种含量较高的有机酸,对其余有机酸的定性和定量检测将是后续研究的重点。朱其瀚[26]从镇江香醋醋醅中筛选出一株巴氏醋杆菌,经测定可产乳酸、乙酸、酒石酸三种有机酸,相比之下生料醋中有机酸的种类更丰富,因此口感更为独特。

图7 L4发酵液有机酸色谱图

2.5 有机酸的检测

2.5.1 巴氏醋杆菌发酵过程中乙酸含量的变化 分析图8可得发酵过程中乙酸质量浓度的变化情况,巴氏醋杆菌在0～64 h发酵过程中乙酸含量略有波动但差异不显著,维持在0.7 mg/mL左右,72～116 h乙酸质量浓度逐渐增加,72 h增速极显著(P<0.01),可能是一部分乙醇被醋酸菌转化为了乙酸,116 h乙酸质量浓度显著增加且达到发酵过程中的最大值为1.8 mg/mL,低于镇江香醋中乙酸的含量(4.95 mg/mL)[27],原因可能是单独一株菌发酵与醋醅发酵微生物坏境有差距,造成乙酸含量低。

图8 乙酸质量浓度变化

2.5.2 巴氏醋杆菌发酵过程中乳酸含量的变化 由图9可得,巴氏醋杆菌发酵培养前期乳酸质量浓度为0.6 mg/mL,在8～64 h之间乳酸含量缓慢增加,72 h时极显著增加(P<0.01),达到了1.8 mg/mL,在116 h乳酸含量达到最大为2.1 mg/mL。可能由于EMP途径将丙酮酸还原成乳酸[28],乳酸含量呈增加趋势。生料醋中乳酸含量高于乙酸,乳酸作为不挥发酸赋予了食醋柔和的口感,可能也是生料醋口感更加绵柔的原因。

图9 乳酸质量浓度变化

2.5.3 巴氏醋杆菌发酵过程中草酸含量的变化 由图10可知,草酸的质量浓度在整个发酵过程中差异显著,在0.4～1.23 mg/100 mL之间波动。0～72 h逐渐上升并在72 h达到最高为1.23 mg/100 mL,80～116 h草酸含量略有波动。

图10 草酸质量浓度的变化

2.5.4 巴氏醋杆菌发酵过程中柠檬酸含量的变化 食醋中柠檬酸主要起调和口感的作用[29],由图11可知巴氏醋杆菌的发酵过程中含量缓慢增加,维持在0.08～0.11 mg/mL之间,104 h含量最高,达到最大为0.11 mg/mL。

图11 柠檬酸质量浓度变化

2.5.5 巴氏醋杆菌发酵过程中琥珀酸含量的变化 琥珀酸作为醋中一种调味的有机酸,可中和乙酸引起的苦涩感,增加食醋的香醇味。由图12可知,琥珀酸在整个发酵过程中质量浓度呈波浪型变化,0～32 h琥珀酸含量逐渐增加且增速显著(P<0.05),32～80 h略有波动,104 h琥珀酸含量显著(P<0.05)下降,可能是发酵过程中酸的含量增加,pH降低抑制了一些微生物的生长,影响了琥珀酸的含量,在发酵后期116 h琥珀酸含量达到平衡，为0.31 mg/mL。

图12 琥珀酸质量浓度变化

3 结论

本试验从生料醋醅中分离纯化出巴氏醋杆菌,在16 h菌落数达到最大为2.0×108CFU/mL,20 h后醋杆菌进入了衰亡期。发酵前期主要是厌氧发酵,因此醋酸杆菌能将糖氧化产生乳酸,成为发酵过程中的主要有机酸,乳酸、乙酸作为醋中主要的挥发酸,含量变化显著(P<0.05)。巴氏醋杆菌发酵过程中乳酸含量在92 h略有下降可能是作为碳源被利用的原因[30]。发酵过程中产量最高的有机酸为乳酸,草酸含量最低。柠檬酸在整个发酵过程中含量没有明显变化,琥珀酸是除乳酸外含量最丰富的特征性有机酸。