新冠疫苗研发进展及在疫苗学教学改革的探索

黄挺，褚以文，黄金竹

(成都大学四川抗菌素工业研究所，抗生素研究与再评价四川省重点实验室，成都 610052)

由新型冠状病毒(2019-novel coronavirus,2019-nCOV)引起的新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)已正式被命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)，目前对全球公共卫生造成了严重的威胁[1-2]。虽然2019年12月COVID-19的暴发主要集中在中国武汉，但是截至2020年6月28号，该疾病已经传播了超过200多个国家和地区，确诊病例超过1000万，确诊死亡人数超过50万[3]。此外，强制性的隔离导致了数以千万人的生活和工作受到了影响。如果COVID-19没有得到有效的控制，它将给各国人民生命安全和社会发展带来巨大的挑战，并对全球经济产生深远的影响[1-2]。

冠状病毒含有一个被包裹在膜包膜内的单链RNA基因组，病毒外膜上镶嵌着糖蛋白刺突，使其具有冠状外观。虽然冠状病毒能够同时感染人和动物，但是对于像蝙蝠这种体内寄居着多种冠状病毒的动物，却很少受到冠状病毒的攻击[4]。冠状病毒主要有四类，分别为α，β，γ和δ冠状病毒。其中β类冠状病毒包括严重急性呼吸综合征病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)，中东呼吸综合征病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)和COVID-19病原体SARSCoV-2。与SARS-CoV相似，SARS-CoV-2主要感染机体的下呼吸系统从而引起病毒性肺炎，同时也可能感染胃肠系统，心血管系统和中枢神经系统，并导致多器官衰竭[5]。

迄今为止，世界各国还没有生产出针对SARSCoV-2特异性抗病毒药物。加强预防性SARS-CoV-2疫苗的研发，对COVID-19疫情的紧急防控和长远防治具有重要的意义。本文将综述COVID-19疫情暴发至今，国内外已报道的SARS-CoV-2疫苗研发工作，包括全球多个科研机构已发表的科学文献和专利[6-7]。为支持研究和开发有效的COVID-19的疫苗和预防性药物提供基础的理论和实践数据，也为疫苗学实验教学改革提供重要的参考信息。

1 SARS-CoV-2的基本结构与功能

β冠状病毒基因组能够编码几种重要的结构蛋白，包括负责病毒装配的膜蛋白(membrane protein，M)和包膜蛋白(envelop protein，E)，负责RNA合成的核衣壳蛋白(nucelocapsid protein，N)，以及在病毒感染的第一步发挥重要作用的糖基化刺突蛋白(spike protein,S)。S蛋白通过与位于宿主细胞表面膜上的血管紧张素转化酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)受体蛋白结合，辅助SARS-CoV-2入侵宿主细胞，这种入侵过程还需要S蛋白和宿主细胞的丝氨酸蛋白酶TMPRSS211共同触发来完成[8-9]。因为它可以启动感染过程，所以冠状病毒S蛋白与ACE2在宿主细胞表面上的相互作用非常重要。Cryo-EM结构分析表明，SARS-CoV-2的 S蛋白与ACE2的结合亲和力比SARS-CoV 的S蛋白高约10～20倍[8,10]。所以与SARS-CoV相比，SARS-CoV-2可能具有更高的传播性和传染性[11]。

除了结构蛋白之外，病毒基因组还编码几种非结构蛋白，包括RNA依赖的RNA聚合酶(RNAdependent RNA polymerase,RdRp)、冠状病毒主蛋白酶(coronavirus main protease,3CLpro)和类木瓜蛋白酶(papain-like protease,PLpro)[12-13]。进入宿主细胞后，病毒基因组以单链RNA的形式释放。随后，利用宿主细胞蛋白翻译机制将其翻译为病毒蛋白，然后通过3CLpro和PLpro将其切割成效应蛋白。而RdRp可以合成一条长副链RNA模板使其生成出更多的病毒基因组RNA[12-13]。

针对这次暴发的SARS-CoV-2，已有研究学者利用最新的基因组测序技术并结合生物信息学方法，快速地鉴定出很多SARS-CoV-2的S蛋白和N蛋白在T和B细胞上面的抗原决定簇[14-15]。更重要的是，以这些保守的表位序列为靶标而设计的疫苗，将会保护机体并触发积极的免疫应答对抗SARS-CoV-2的攻击。

2 新冠疫苗疫苗研发概况

2.1 新冠疫苗疫苗研发现状

开发安全有效的疫苗对于控制COVID-19的传播并预防其未来的二次爆发具有显著的重要性。据统计，目前全球处于研发阶段的SARS-CoV-2候选疫苗共有超过115种[16]，包括无活性或减毒活病毒疫苗，腺病毒载体疫苗，重组蛋白疫苗，类病毒颗粒疫苗，病毒载体疫苗和核酸疫苗(DNA疫苗和mRNA疫苗)，首批已有多个SARS-CoV-2疫苗进入I期和II期临床试验[6]。以下的报道主要描述了国内外不同类型SARS-CoV-2疫苗的研发现状。

2.2 灭活病毒疫苗

灭活病毒疫苗系用SARS-CoV-2接种Vero细胞，经病毒培养、灭活、纯化并吸附特定免疫佐剂制成。目前全球有超过4个COVID-19灭活病毒疫苗处于临床试验期。例如，在2020年4月12日由武汉生物制品研究所有限责任公司和中国科学院武汉病毒研究所联合研制的新型冠状病毒灭活疫苗已进入临床试验，这是全球首个进入临床试验阶段的COVID-19灭活病毒疫苗[17]。紧接着在2020年4月13日，由北京科兴中维生物技术有限公司研制的SARS-CoV-2灭活病毒疫苗获批开展I期临床试验[7]。与此同时，在2020年4月28日由北京生物制品研究所有限责任公司和与中国疾病预防控制中心(Chinese center for disease control and prevention,CDC)下属的病毒病预防控制所合作研发的新型冠状病毒灭活疫苗启动了Ⅰ期临床试验。令人欣喜的是，2020年6月20日由中国医学科学院医学生物学研究所自主研制SARS-CoV-2灭活疫苗在云南省红河州已正式启动了II期临床试验。

2.3 腺病毒载体疫苗

由中国人民解放军军事科学院主导开发的重组新型冠状病毒疫苗(Ad5-nCoV)是全球首个进入临床试验的COVID-19腺病毒载体疫苗。该疫苗是可表达SARS-CoV-2 的S蛋白的复制缺陷型人腺病毒5型，Ⅰ期临床试验已于2020年3月16日启动[18]。目前处于Ⅱ期临床试验阶段，计划招募近500位受试者以评价不同剂量疫苗的安全性及其免疫原性[19]。除此之外，由英国牛津大学主导研发的腺病毒载体的COVID-19候选疫苗(ChAdOx1 nCoV-19)已完成Ⅰ、Ⅱ期临床试验的注册。该疫苗Ⅰ、Ⅱ期试验将招募近500位处于18至55周岁之间的健康受试者，以评价疫苗的安全性和疫苗诱导宿主的S特异性抗体、中和抗体以及特异的细胞免疫应答[20]。

2.4 重组蛋白疫苗

在2020年2月下旬，葛兰素史克公司(GSK)宣布与中国的三叶草生物制药公司合作研发冠状病毒(COVID-19)候选疫苗[21]。这项合作利用到三叶草公司基于蛋白质的冠状病毒候选疫苗(COVID-19 S-Trimer)与GSK自主研发的佐剂系统。通过应用三聚体融合蛋白技术和基于哺乳动物细胞培养的高效表达系统，三叶草公司能快速生产出S-三聚体亚基疫苗，再结合特殊的佐剂系统，从而更好地靶向改进先前的非药物途径。近日，Generex公司宣布与中国技术交流中心、北京中华投资基金管理公司、山东省科学院生物研究所以及中化国际倡导国际产业发展组织组成的联合协会签订合同，开发COVID-19疫苗。该公司将利用其Ii-Key免疫系统激活技术生产用于人类临床试验的COVID-19病毒肽[22]。

2.5 类病毒颗粒疫苗

2015年，诺瓦瓦斯克公司(Novavax)发明了一种具有免疫原性的化合物，该化合物由杆状病毒在Sf9细胞中高表达产生的S蛋白三聚体和MERS-CoV纳米类病毒颗粒组成。当它们与专有佐剂基质M(RN 1235341-17-9)一起给药时，这种类病毒颗粒制剂在小鼠和转基因牛中都诱导了中和抗体应答反应。诺瓦瓦斯克公司在2020年2月26日宣布，基于先前研究其他冠状病毒(包括MERS和SARS)的经验，目前正在开展COVID-19候选疫苗的动物测试[23]。他们使用重组纳米颗粒疫苗技术及其专有佐剂Matrix-M开发出针对SARS-CoV-2的S蛋白的COVID-19候选疫苗[24]。

2.6 基于DNA的疫苗

DNA疫苗是通过编码抗原的基因插入到真核表达载体，直接对动物进行接种免疫，在诱导宿主产生适应性免疫应答的一门技术[25]。在一份研发冠状病毒疫苗的专利(WO2015081155)中报道了一种高效的免疫原，其包含来自MERS-CoV刺突蛋白的共有蛋白，可被用于制造靶向MERS-CoV的DNA疫苗。共有刺突蛋白能够显著增强宿主的体液和细胞免疫反应，包括增加IgG和中和抗体的效价和宿主的T细胞反应。

基于先前研究者开发MERS-CoV疫苗的经验，美国Inovio制药公司研发出可表达SARS-CoV-2的 S基因的DNA疫苗(INO-4800)，是已经进入临床试验的预防性COVID-19候选疫苗，该疫苗通过密码子优化技术提高了S的表达水平并增强了其免疫原性。2020年3月2日，Inovio制药公司首次公布了INO-4800疫苗的实验结果，实验结果显示在小鼠和豚鼠经过不同剂量的INO-4800疫苗接种免疫后均可产生良好的细胞免疫应答或抗体应答[26]。紧接着在2020年4月8日，INO-4800进入临床试验阶段，包括评价DNA疫苗的初步安全性和DNA疫苗诱导的特异性抗体和细胞免疫应答[27]。

2.7 基于mRNA的疫苗

预防性mRNA疫苗的作用机制与DNA疫苗类似，也能刺激宿主产生强烈的免疫反应，以及具有将多种mRNA组合成单一疫苗的能力。在Moderna公司的一份专利报告(WO2017070626)中报道了一种针对冠状病毒的mRNA疫苗，该疫苗由编码来自SARS-CoV和MERS-CoV病毒的S、S1或S2蛋白的mRNA和阳离子纳米颗粒组成。他们发现，与编码S蛋白S2亚基的mRNA相比，小鼠在接种编码冠状病毒全长S蛋白的mRNA后能产生更高的中和抗体效价。基于先前的研发经验，Moderna公司在2020年2月24日宣布，他们已生产第一批针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗(mRNA-1273)[28]，这是一种编码SARSCoV-2融合前稳定形式的S蛋白的mRNA疫苗。小瓶装的mRNA-1273已被运送到美国国立卫生研究院(National Institutes of Health,NIH)的下属部门-美国过敏和传染病研究所(NIAID)疫苗研究中心，将用于I期临床试验[29]。除此之外，德国BioNTech公司和美国辉瑞公司共同开发针对COVID-19的 mRNA疫苗(BNT162)目前也已进入临床试验。该Ⅰ、Ⅱ期临床试验将招募超过7000名健康受试者，评价不同剂量的COVID-19的 mRNA疫苗的安全性、免疫原性及其免疫保护能力[30]。

3 新冠疫苗研发在疫苗学实验教学改革的作用和意义

疫苗学实验是近些年在部分生物类专业新增的一门课程，它的主要实验教学内容是让学生进一步了解疫苗制造的原理方法并学习掌握其生产工艺流程。但是因为其发展的历程较短，涉及的交叉科学较多如微生物学和免疫学等，课程建设也不完善，很多教学问题亟待解决。例如很多师生没有接受过系统的生物安全教育培训，很多学生没体会到无菌操作的重要性，实验教学时间的安排不够合理等等。目前，世界各国高校及科研机构正大力研发新型冠状病毒疫苗，借鉴他们一些宝贵的研发经验，为疫苗学实验教学改革提供重要的参考信息。例如疫苗免疫效果的检测是评价疫苗效用的重要手段之一，其实验教学离不开传染性微生物的使用，通过增强实验课前的系统而全面的生物安全培训可以有效防止相关教学事故的发生，并且提高了疫苗学实验教学的质量。其次是强化疫苗学教学实验中的无菌观念，提高其无菌操作技术。疫苗的免疫接种是有周期的，如新型冠状病毒疫苗的免疫接种周期在2周至一个半月左右[7,27]，在疫苗学实验教学过程中合理安排好免疫接种时间，可以保证实验的连续性、完整性和科学性，使学生充分理解实验的目的与意义[31]。

4 结论与展望

目前世界各国的科研机构以及生物医药公司正在积极地参与SARS-Cov-2疫苗的研发工作，传统疫苗和新型疫苗研发共同推进，疫苗研发机构、医药生产企业、医疗单位以及公共卫生部门也正加大合作力度和信息资源共享。基于早些年研究者对SARS和MERS疫苗研究开发的经验以及近年来疫苗制备技术的快速发展，同时随着对SARS-Cov-2感染与免疫机制的阐明和临床前研究/人体临床试验评价工作的推进，我们相信SARS-Cov-2疫苗的研发过程会大大缩短并有望尽快获批上市，基于SARS-Cov-2疫苗研发的宝贵经验，也对疫苗学实验教学改革具有积极的意义。如果有SARS-Cov-2疫苗作为战略储备，当COVID-19二次暴发时我们可能再不会如此被动。