高效液相色谱法测定小麦粉及其制品中的间苯二酚

别 梅 宿书芳 武传香 刘艳明

(山东省食品药品检验研究院, 济南 250000)

间苯二酚(Resorcinol)是一种重要的化工原料，也是实验室中一种常用试剂[1]，已被证实为内分泌干扰物，长期接触可导致皮炎、黏膜炎、惊厥和发绀等[2]问题。因此，在医药和化妆品产品中有着严格的使用限量[3]。在食品领域，GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》将其列为允许使用的食品用合成香料，在各类食品中按生产需要适量使用。但依据原食药总局关于进一步加强小麦粉质量安全监管的公告(2017年第132号)，小麦粉中禁止添加过氧化苯甲酰、次磷酸钠、硫脲、间苯二酚等非食品原料。因此，加强小麦粉中间苯二酚的使用监管尤为重要。目前，小麦粉及其制品中间苯二酚的检测鲜见方法标准和文献报道，不仅导致小麦粉及其制品生产企业在原料进货查验、出厂检验等环节缺少高效、可靠的检验方法，还影响食品药品监管部门对小麦粉及其制品生产企业的日常监督检查与风险监测。综上，研究建立小麦粉及其制品中间苯二酚的检测方法意义重大。

已报道的测定间苯二酚的方法有分光光度法[5]、电化学法[6]、同步荧光法[7]、气相色谱法[8]、气相色谱质谱法[9]、离子色谱法[10]和液相色谱法[11-15]等，其中液相色谱法最为普遍和可靠，检测器多为紫外或荧光检测器，在小麦粉中的检测报道不多，而小麦粉制品中的使用鲜见报道，本研究将GB 2760—2014中小麦粉及小麦粉制品分类下的各个子类作为研究对象，建立一种通用的测定间苯二酚含量的高效液相色谱方法，采用二极管阵列检测器和荧光检测器串联检测，有效避免了单一检测器定性手段单一的问题，较为有效地减少假阳性的存在，增强定性定量可靠性，方法操作简单、灵敏度高、选择性好、检出限低，适用于小麦粉及其制品中痕量间苯二酚的定性、定量检测，能满足监管需要。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

间苯二酚标准品、甲醇：色谱纯、亚铁氰化钾、乙酸锌：优级纯、有机相微孔滤膜：0.22 μm。实验室用水符合GB/T 6682—2016规定的一级水要求。

小麦粉、馒头、油条、面条、炸鸡粉：市售。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪配二极管阵列检测器和荧光检测器，超声清洗仪，离心机。

1.3 标准溶液配制

准确称取10 mg间苯二酚标准品于10 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到浓度为1 mg/mL的标准储备液，工作溶液用甲醇逐级稀释。

1.4 样品前处理

称取5 g样品于25 mL比色管中，加入15 mL甲醇涡旋混匀，超声15 min, 加入1 mL亚铁氰化钾(0.25 mol/L)和1 mL乙酸锌(1 mol/L),用甲醇定容至刻度，摇匀。于7 000 r/min离心3 min，取上清液过0.22 μm有机相滤膜，待上机。

1.5 仪器条件

色谱柱：C18-Amide (3.5 μm,150 mm×4.6 mm)；流动相：A为水，B为甲醇，梯度洗脱，洗脱程序见表1；柱温：40 ℃；进样体积：10 μL；二极管阵列检测器(PDA)串联荧光检测器，PDA检测器检测波长273 nm，荧光检测器激发波长273 nm，发射波长304 nm。

表1 梯度洗脱程序

2 结果与讨论

2.1 实验条件优化

2.1.1 色谱柱及流动相的选择

文献报道中，间苯二酚的分离测定多使用C18柱。实验发现，间苯二酚在常规C18柱上出现峰拖尾现象，导致分离度降低、灵敏度减弱，精密度变差，从而影响定量结果的准确性。通过比较发现，C18-Amide柱能有效解决间苯二酚的拖尾问题。比较了C18柱和C18-Amide柱的峰形(图1)，在测试液浓度为10 μg/mL时，C18柱色谱峰拖尾因子为1.768，而C18-Amide的拖尾因子为1.082，拖尾因子明显降低，峰形对称良好。这是因为C18-Amide柱是一种复合作用模式的色谱柱，在C18疏水作用的基础上，键合的酰胺基可以增加极性化合物的保留并提供替代选择性，从而改善了含酚羟基等极性基团的化合物的保留。实验最终选择C18-Amide为间苯二酚的分离色谱柱。实验还考察了不同流动相条件对间苯二酚的保留行为的影响。分别以甲醇/水、乙腈/水、甲醇/醋酸铵(20 mmol/L)、乙腈/醋酸铵(20 mmol/L)为流动相，考察间苯二酚的保留及分离情况。结果表明，几种流动相条件下峰形和保留均无明显差别。从经济角度及操作实用性等方面考虑，选择甲醇/水作为流动相。

图1 不同色谱柱的峰形比较

2.1.2 检测波长的选择

采用PDA检测器，提取间苯二酚的光谱图(图2)，由图2可以看出，目标物在196.7 nm和273.4 nm处有最大吸收和特征吸收。由于196.7 nm波长较短，干扰较多，故选择273 nm为PDA检测器的检测波长以及荧光检测器的激发波长。固定激发波长，对发射波长进行扫描，发现在304.7 nm处荧光响应最强(图3)。因此确定荧光检测器激发波长λex为273 nm, 发射波长λem为304 nm。

图2 间苯二酚在190-750 nm波长范围内的光谱图

图3 激发波长273 nm时的发射波长扫描图

2.1.3 前处理条件的优化

间苯二酚易溶于水、甲醇、乙醚等溶剂。小麦粉及其制品多为高淀粉基质，若直接以水为提取剂，样品的分散性较差，回收率较低。实验分别以不同比例的甲醇/水为提取剂，比较不同提取剂的提取回收率，间苯二酚的回收率随甲醇浓度增高而增高，当甲醇比例到达80%后，回收率趋于稳定。由于馒头、面条等小麦粉制品吸水性较强，从精准定量的角度，选择纯甲醇为最优的样品提取剂。

实验考察了前处理沉淀剂对目标物回收率及净化效果的影响。结果发现，加与不加亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀剂对回收率及色谱峰均无明显差异。但是不经沉淀处理的样品溶液，在冷藏或长时间放置后会析出沉淀物，不利于批量样品的同时测定。而经沉淀处理的样品溶液不因放置时间的长短而出现沉淀物。因此，批量测定时，在不能保证立即进行仪器分析的情况下，加入沉淀剂可保证溶液在冷藏条件下较长的时间保持澄清透明。

2.2 方法学性能考察

2.2.1 方法的线性和检出限

将间苯二酚标准储备液用甲醇逐级稀释至0.01、0.02、0.1、0.2、0.4、1、5、10 μg/mL，并依次注入液相色谱仪，以峰面积和测试液浓度做曲线。检出限和定量限为色谱图信噪比(S/N)等于3和10时所对应的样品中间苯二酚的含量。两种检测器的线性范围、相关系数、检出限和定量限见表2。结果显示两种检测器在各自的线性范围内线性良好，且荧光检测器的灵敏度更高。

表2 两种检测器的线性范围、相关系数和定量限

2.2.2 方法的准确性与精密度

选取小麦粉及其制品(自发粉、鲜面条、干面条、馒头、裹粉和油条)，分别加入一定量的间苯二酚标准溶液，加标水平分别为方法定量限、2倍方法定量限和10倍方法定量限，每个水平平行测定6次，考察方法的回收率及精密度并对比两种检测器共有的线性范围内的(加标水平为1 mg/kg和2 mg/kg)样品的PDA定量结果和荧光定量结果。

加标量为0.05、0.1、和0.5 mg/kg的样品以荧光检测器的定量结果来计算回收率，加标量为1、2和10 mg/kg的样品以PDA检测器的定量结果来计算。小麦粉样品的回收率在90.3%～103.2%之间，其他样品的回收率也均在73%～108.6%范围内，相对标准偏差均小于8.2%。结果见表3。

在GB 27404—2008检测方法的确认要求中规定，加标量在1～10 mg/kg之间，回收率范围为90%～110%；在0.1～1 mg/kg之间，范围为80%～110%；加标量<0.1 mg/kg时，回收率范围在60%～120%之间。本方法的回收率除加标水平为0.05 mg/kg的样品的回收率在60%～120%之间外，其他加标水平的样品的回收率均在90%～110%之间。GB 27404中实验室内变异系数随待测组分含量的增加而减小，当待测组分的含量为0.1 mg/kg时RSD<15%，10 mg/kg时RSD<7.5%,方法最低加标量0.05 mg/kg的RSD为4.5%～8.2%,其他加标水平的RSD<5.5%。结果表明，方法的回收率和精密度均满足标准要求。加标水平为1 mg/kg和2 mg/kg的每一个样品的PDA定量结果和荧光定量结果经过比对，其偏差的绝对值均小于5.2%，差异较小。

表3 不同样品添加回收率与精密度

2.2.3 方法的特异性

为考察方法的特异性，对空白样品和加标样品按照相同的前处理和仪器条件进行分析，得到的谱图(图4)表明，在间苯二酚保留时间处没有明显的干扰峰。实验还考察了间苯二酚两种同分异构体邻苯二酚和对苯二酚对目标物的干扰情况，发现在本方法建立的流动相条件下，三种同分异构体能有效分离，其分离色谱图见图5。综上，方法的特异性较强，有效避免了复杂基质中假阳性的影响。

图4 间苯二酚标准物质、空白样品和空白样品加标色谱图

图5 苯二酚三种同分异构体的分离色谱图

2.3 方法的应用

方法的检测器采用二极管阵列和荧光检测器串联，间苯二酚测试液浓度在两者共同的线性范围内时两种检测器可以同时用于定量，差别不大，在定性时根据目标峰在两个检测器采集的谱图的同一保留时间处是否同时出现相互佐证；测试液浓度超出荧光检测器的线性范围但在PDA检测器的线性范围之内的可用PDA定量，目标物的紫外吸收光谱图和荧光检测器的谱图辅助定性，或者稀释至两种检测器共同的线性范围；荧光检测器灵敏度高，适用于含量<1 mg/kg的样品的检测，但浓度低于PDA的检出限时，定性方式也较单一。

对购买自超市和网络两种渠道不同品牌的小麦粉、面条、馒头等样品共计50批次，按本方法建立的前处理方法进行处理与上机测定，未发现间苯二酚阳性样品。

3 结论

本方法建立了高效液相色谱-PDA-荧光串联法测定小麦粉及其制品本方法中间苯二酚的含量，二极管阵列和荧光检测器的定量结果均具备良好特异性，且在各自线性范围内r2>0.999，定量限分别为1 mg/kg和0.05 mg/kg，回收率73.0%～108.6%，RSD<8.2%，两种检测器的定量结果偏差<5.2%。方法操作简单、线性良好、准确度高，两种检测器串联使用，增加了定性定量的准确性。该方法为小麦粉及其制品的监管和风险监测提供有效的技术支持，也为今后小麦粉及其制品加工过程中间苯二酚含量变化趋势研究提供参考。