玉米醇溶蛋白/明胶/羟基磷灰石纳米纤维膜制备及其性质研究

邓伶俐 张 辉

(湖北民族大学生物科学与技术学院；生物资源保护与利用湖北省重点实验室；超轻弹性体材料绿色制造国家民委重点实验室1，恩施 445000) (浙江大学生物系统工程与食品科学学院;浙江省农产品加工技术研究重点实验室;浙江省食品加工技术与装备工程中心2，杭州 310058)

静电纺丝技术利用高压电场将高分子溶液牵拉向低电势方向伸展形成纳米级或微米级的纤维并沉降于接收端。静电纺丝纳米纤维被认为在许多领域具有巨大的应用潜力，如生物医药、过滤吸附、化妆品、食品等领域[4]。静电纺丝纳米纤维在食品行业的应用刚刚起步，由于纳米纤维具有直径小、比表面积大，结构可控等优点，在生物活性物质载运、活性包装、环境响应性释放等方向具有良好的应用前景[5]。由于食品行业对安全性及可降解性的要求，越来越多的研究者关注到天然高分子纳米纤维的制备及改性的工作[6]。

通常将天然高分子纳米纤维膜进行应用研究均需要对其进行交联，可以通过化学法或者酶法交联[7, 8]。最常见的交联方式是戊二醛熏蒸[9, 10]，但是研究表明戊二醛残留具有细胞毒性[11, 12]。考虑到交联剂的毒性可能对后期应用在食品行业有不利影响，必须选择更加安全的交联方式。前期研究表明通过将明胶与玉米醇溶蛋白混合静电纺丝可一定程度改善单一组分纳米纤维膜的机械性能和溶剂稳定性，但其对纳米纤维膜综合性能提升效果还不足以将其实际应用。近期研究表明通过添加葡萄糖诱导的美拉德反应能够提升天然高分子纳米纤维膜的综合性能[13, 14]。

已有研究表明通过向纳米纤维中添加无机物能够显著提升其综合性能，改善其机械性能，改变纳米纤维膜的亲疏水性。Mirmusavi等[15]发现向聚3-羟基丁酸酯/壳聚糖/丝素蛋白复合纳米纤维中添加碳纳米管能将其拉伸强度从41.18 MPa增加至46.68 MPa。en等[16]研究表明氮化硼纳米管显著提升了明胶纳米纤维的拉伸强度，从0.48 MPa增加至0.77 MPa。Ngiam等[17]向PLGA纳米纤维中添加纳米羟基磷灰石发现其接触角从75.9°增加至107.5°，而PLGA/胶原蛋白纳米纤维膜的接触角从54.6°降低至11.2°。Ao等[18]发现添加5%纳米羟基磷灰石到乙基纤维素纳米纤维膜中能够将其拉伸强度从52.9 MPa提升到70.9 MPa。研究发现纳米羟基磷灰石增加了PLA纤维膜和PU膜的亲水性[19, 20]。

本研究旨在通过添加纳米羟基磷灰石到玉米醇溶蛋白/明胶纳米纤维中制备三元复合纳米纤维体系并改善纳米纤维膜的机械性能和浸润性。通过扫描电子显微镜和透射电镜观察纳米纤维微观形态变化以及纳米羟基磷灰石在纳米纤维中的分布。通过傅里叶红外光谱研究组分间的分子间相互作用以及蛋白二级结构的变化。通过接触角测试表征纳米纤维膜浸润性的变化，并通过表面元素分析其亲疏水基团比例。通过拉伸测试来研究纳米羟基磷灰石对复合膜机械性能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米醇溶蛋白(Z3625)、明胶(药用级)、纳米羟基磷灰石(纯度≥97%，颗粒直径<100 nm)；葡萄糖、乙酸均为分析纯。

JDF05型静电纺丝机，MCR302旋转流变仪， SU8010扫描电子显微镜，170-SX傅里叶红外光谱仪，Q200差示量热扫描仪，Q500热重分析仪，Q800动态机械分析仪，X-pert PowderX射线衍射仪，OCA-20视频接触角测试仪，AXIS SUPRA 型X射线光电子能谱仪，AGS-J万能测试机。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制及流变性测试

将玉米醇溶蛋白(2.25 g)，明胶(0.75 g)，葡萄糖(0.5 g)溶于 10 mL 80%乙酸溶液，然后分别加入纳米羟基磷灰石0、0.3、0.75、1.5 g，对应相比于总蛋白量的质量浓度0、10%、25%、50%，分别简写为HAP0、HAP10、HAP25、HAP50。搅拌12 h使其充分溶胀。

将溶液利用旋转流变仪选用CP50锥板进行旋转测试和振荡测试。在25 ℃下设置剪切速率为0.1～1 000 s-1，测定黏度随剪切速率的变化。溶液的振荡测试频率范围为0.1～100 rad/s，测定溶液的弹性模量和损失模量随振荡频率的变化。

1.2.2 静电纺丝过程

静电纺丝装置如图1，首先将高分子溶液吸入5 mL塑料注射器中，通过注射泵以1.0 mL/h的速率进行推进，前端针头直径为0.06 mm的不锈钢平头点胶针(20 G)。静电纺丝过程电压控制在15 kV，针头至转鼓接收端的距离为10 cm。湿度为40%～60%，温度为20～25 ℃。将得到的纳米纤维膜在140 ℃条件下处理3 h以达到美拉德交联的目的[13]。

图1 静电纺丝装置示意图

1.2.3 扫描电镜分析

剪取纳米纤维膜，经真空喷金处理后，于扫描电子显微镜上观察纳米纤维的微观形貌。使用软件Nano Measure从纳米纤维的扫描电子显微镜图中选取3张放大倍数为5 000倍的电镜图，每张图随机选取40根纤维，对其直径进行统计，根据所得数据计算得出纤维平均直径并作直径分布直方图。

1.2.4 纳米纤维膜表征

采用傅里叶变换衰减全反射法进行红外光谱扫描，扫描范围为：4 000～400 cm-1，分辨率：4 cm-1，累加32次，以空气为背景，每次扫描前扣除背景。用软件Peak Fit v4.12拟合谱图中的酰胺I带。首先进行基线校准，然后通过二阶导数进行拟合，完全分辨开不同的谱带。每个子峰的面积占所有峰总面积的比值就是该峰所对应的构象的含量所占的比值。

采用接触角测量仪测定水接触角。将样品固定在载玻片上，采用去离子水作为探针溶剂在室温下进行测量。每个样品重复测量3次。

采用X射线光电子能谱仪用于分析膜表面元素。光源为Al Kα X射线光源 (1 486.6 eV)。宽扫范围为0～1 000 eV，扫描频率为1.0 eV。精细扫描的频率为0.1 eV。采用Origin pro9软件拟合C1s精细扫描光谱图。以284.8 eV作为C―C/C―H的特征峰，进行光谱校正[21]。

将电纺膜剪成2 cm× 2 cm的片状，在X-pert Powder衍射仪上进行检测分析，CuKα(λ = 1.540 6 Å)，倾角0.02°，扫描速度1°/min，扫描范围2θ=5°～90°，电压40 kV，电流200 mA。

将电纺膜(厚度约0.1 mm)剪成1 cm × 4 cm条状，利用AGS-J万能测试机进行力学性能测试。将纤维膜放入夹具，输入样品精确的宽度、长度、厚度，拉伸载荷为5 N，拉伸速率为1 mm/min，每个样品重复5次。

1.3 数据分析

统计学分析使用t分布检验单因素方差分析(ANOVA one way)，后续使用Tukey分析进行检验，分析软件为Origin 8.0。当P<0.05时，结果被认为具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 流变性质分析

图2为玉米醇溶蛋白/明胶及含不同浓度纳米羟基磷灰石(nHAP)的溶液黏度随着剪切速率的变化图。可以看出所有溶液都为剪切变稀溶液，这是由于高分子缠联网络在高剪切速率的条件下被破坏。高分子缠联网络被破坏和重构的过程无法达到平衡，最后无法抵御剪切力的作用发生剪切变稀的现象[22]。表1为根据幂定律进行拟合得到的结果。当n小于1时说明溶液为剪切变稀非牛顿流体，研究表明适当的剪切变稀现象时有助于静电纺丝过程顺利进行的[23, 24]。随着nHAP含量的增加，溶液的黏度增加，但是其剪切变稀现象更明显。说明nHAP与蛋白之间发生了相互作用，增加了分子间的摩擦，从而黏度增加[25]。

图2 玉米醇溶蛋白/明胶/羟基磷灰石溶液的旋转测试剪切速率-粘度曲线

通过对溶液进行振荡测试频率扫描发现储存模量(G′)和损失模量(G″)均随着振荡频率的增加而增加。所有溶液都能够观察到G′和G″的交叉点，说明其既具有黏性也具有弹性，分子网络进行了有效缠联，有利于静电纺丝的进行[26]。而G′和G″的交叉点随着nHAP含量的增加，交叉点向高频率移动。已有研究表明G′和G″的交叉点能够反映溶液中的缠联密度，而交叉点向高频率移动说明了缠联密度的降低，这与剪切测试中更显著的剪切变稀现象所对应[18, 27]。

表1 玉米醇溶蛋白/明胶/羟基磷灰石溶液旋转切速率-剪切应力图幂定律拟合结果

图3 玉米醇溶蛋白/明胶(3∶1，m/m)纳米纤维(HAP0)含有10%(HAP10)、25% (HAP25)、50% (HAP50) 羟基磷灰石的纳米纤维电镜图和直径分布

2.2 纳米纤维形态分析

图3为含有不同nHAP浓度的纳米纤维的形态及直径分布。玉米醇溶蛋白/明胶纳米纤维直径为112 nm，而HAP10、HAP25、HAP50纳米纤维的直径分别为248、249、220 nm。nHAP的加入显著增加了玉米醇溶蛋白/明胶纳米纤维的直径，但不同浓度之间没有显著差异。从HAP10纳米纤维的透射电镜图可以看出nHAP分布在纤维内部，也有一部分nHAP分布在内部和表面，导致纤维表面粗糙。

研究表明黏度变化是影响纤维形态的重要因素，大多数研究表明黏度增加会引起纤维直径的增加[28]。nHAP的加入显著增加了溶液的黏度导致了纤维直径的增加。但是同时nHAP的加入会增加溶液的电导率，增强纤维的牵伸导致。不同nHAP浓度的溶液虽然黏度随着nHAP浓度增加逐渐增加，但是电导率的增加又一定程度的中和了黏度增加的作用，因此添加了不同浓度nHAP的玉米醇溶蛋白/明胶纳米纤维直径无显著差异。

2.3 红外光谱分析

图4 玉米醇溶蛋白/明胶/羟基磷灰石纳米纤维红外光谱图

图5 玉米醇溶蛋白/明胶/羟基磷灰石纳米纤维中蛋白二级结构比例

图6 玉米醇溶蛋白/明胶/羟基磷灰石纳米纤维接触角

2.4 接触角及表面元素分布

图6为复合纳米纤维膜接触角测定结果。玉米醇溶蛋白/明胶复合纳米纤维膜具有疏水的表面，与前期研究结果一致。随着浸润时间的延长，接触角稍有降低，从136°降低到131°。nHAP的加入对接触角的影响不大，随着nHAP含量的增加，3 s时的接触角随着浓度增加从134°增加到了141°。随着浸润时间延长HAP10和HAP25接触角降低幅度与HAP0无显著差异，但是HAP50在60 s时接触角降低到了124°，说明其浸润性显著增加，可能是由于nHAP结节以及表面粗糙度增加引起了纳米纤维膜网络结构的疏松，更有以利于水分的浸润。研究表明疏水的表面可能更有利于纤维膜的抗生物膜形成。Grenho等[32]研究表明nanoHA1000(1 000 ℃处理)由于具有更疏水的表面相比于nanoHA750(750 ℃处理)更能够抵御细菌的粘附。

纳米纤维膜表面元素通过XPS分析得到。图7a为玉米醇溶蛋白/明胶/nHAP典型的XPS宽扫谱图，除了C、O、N的峰之外，Ca峰和P峰出现在347.2 eV和133.3 eV，说明nHAP也暴露在表面。图7b为表面各元素比例，其中Ca和P元素的比例是远小于其在纤维膜中的质量比的，说明大部分的nHAP是分布在纤维的内部，少量暴露于纤维表面的。随着10% nHAP的加入，O元素比例从34.1%降低到31.5%，而随着nHAP含量继续增加，O元素比例又上升至34.5%和35.4%。HAP25和HAP50样品含有相对较高含量的N元素和相对较低含量的C元素。

图7 玉米醇溶蛋白/明胶/羟基磷灰石XPS宽扫谱图(a)和元素比例(b)

图8 玉米醇溶蛋白/明胶/羟基磷灰石纳米纤维基团分布

2.5 机械性能分析

表2为根据纳米纤维膜应力-应变图得出的弹性模量，拉伸强度和断裂伸长率结果。结果表明随着nHAP含量的增加，纳米纤维膜的弹性模量、拉伸强度和伸长率均降低。已有研究表明由于nHAP在纤维中的聚集和结节会引起纤维膜机械性能的下降[36]。Samadian等[37]也发现nHAP添加到乙基纤维素/明胶纳米纤维中会引起机械性能的下降。Ni等[38]也发现低浓度的nHAP能够一定程度的提升PVA纳米纤维膜的机械性能，高浓度的nHAP降低了高分子网络结构的连续性，从而导致更差的机械性能。

表2 玉米醇溶蛋白/明胶/羟基磷灰石纳米纤维拉伸测试弹性模量，拉伸强度和断裂伸长率

3 结论

制备了美拉德反应交联的玉米醇溶蛋白/明胶/纳米羟基磷灰石复合纳米纤维。nHAP显著增加了玉米醇溶蛋白/明胶复合纳米纤维的直径，归因于纳米羟基磷灰石引起的黏度增加。nHAP与蛋白之间通过氢键相互作用。当nHAP添加浓度为10%时引起了蛋白二级结构从β-折叠向转角结构的转变，此时由于纳米纤维膜表面极性基团比例的下降其疏水性增加浸润性下降。而当nHAP添加量为50%时其接触角由于极性基团比例的增加显著降低。但是nHAP的添加对于玉米醇溶蛋白/明胶纳米纤维膜的机械性能没有提升作用，反而其弹性模量和拉伸率均随着nHAP的加入而降低，归因于刚性的nHAP加入降低了蛋白分子网络的弹性和连续性。本研究表明向玉米醇溶蛋白/明胶纳米纤维中添加10%的纳米羟基磷灰石能够提升复合纳米纤维膜的疏水性，降低其被水分浸润的速率，使其应用在食品包装领域的可操作性更好。