猫爪草中穗花杉双黄酮的含量测定*

童晔玲 胡轶娟 # 楼柯浪 陈思思 朱佳依

1 浙江省中医药研究院 浙江 杭州 310007

2 浙江省中药新药研发重点实验室 浙江 杭州 310007

猫爪草为毛茛科小毛茛Ranunculus ternatus Thunb.的干燥块根，具有化痰散结、解毒消肿之功效，用于瘰疬痰核、疔疮肿毒、蛇虫咬伤等[1]。在我国广泛分布于广西、台湾、江苏、浙江、江西、湖南、安徽、湖北、河南等省[2]。现代药理学研究表明，猫爪草具有调节免疫功能[3]、抗肿瘤[4]、抑菌[5]等作用。猫爪草含有黄酮类及其苷类[6]、内酯类、脂肪酸及其酯和甾醇类等[7]。其中穗花杉双黄酮（Amentoflavone）是猫爪草黄酮类成分中的一个重要成分，分子式为C30H18O10，药理学研究证明其具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤[8]和促骨生成的作用。本文建立了猫爪草中穗花杉双黄酮的含量测定方法，为猫爪草质量标准制定提供一定的参考。

1 材料

1.1 实验药品：猫爪草，购自浙江省立同德医院中药房，经鉴定为毛茛科植物小毛茛Ranunculus ternatus Thunb.的干燥块根。穗花杉双黄酮（A0536）：成都曼思特生物科技有限公司。

1.2 仪器：BP211D电子分析天平（万分之一、十万分之一）：Sartorius；Aligent1260液相色谱仪：四元泵、自动进样器、DAD检测器、柱温箱；YMC-Pack ODS-A色谱柱（5μm，250×4.6mm）；甲醇为色谱纯，磷酸为分析纯，水为自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件：色谱柱：YMC-Pack ODS-A（5μm，250×4.6mm）HPLC色谱柱；流动相：甲醇-0.05%磷酸溶液；流速：1.0ml/min；检测波长：269nm，柱温：25℃。在此条件下，样品中穗花杉双黄酮与相邻成分达到基线分离，见图1。

图1 对照品和供试品溶液的高效液相色谱图

2.2 供试品溶液的制备：取本品粉末约0.5g，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇适量，超声处理30min，取出，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取续滤液，即得。进样前用0.45μm微孔滤膜滤过。

2.3 对照品溶液的制备：精密称取穗花杉双黄酮对照品适量，置容量瓶中，加甲醇制成每毫升含0.1mg的溶液，摇匀，即得。

2.4 标准曲线的制备：分别精密吸取对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.0ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取10μl，注入液相色谱仪，测定，记录峰面积，以峰面积A为纵坐标，穗花杉双黄酮的浓度C（μg/ml）为横坐标，绘制标准曲线，结果表明穗花杉双黄酮在1.16～11.6μg/ml范围内呈良好的线性关系（回归方程为：A=10.012C-1.103，r=0.9997）。

2.5 检测限：取穗花杉双黄酮对照品溶液，按比例稀释，测定检测限为1.16ng。

2.6 精密度试验：取本品粉末0.5g，共6份，精密称定，按“2.2供试品溶液的制备”操作，精密吸取10μl，测定，结果猫爪草中穗花杉双黄酮的平均含量为0.0812mg/g，RSD为4.21%。

2.7 加样回收试验：称取已知含量的同一批样品6份，精密称定，置25ml量瓶中，分别精密加入不同量的对照品溶液，按“2.2供试品溶液的制备”操作，测定，计算，平均回收率为98.15%，RSD为3.58%，结果见表2。

表2 样品回收率试验结果

2.8 样品测定：分别取5个不同批号样品，按“2.2供试品溶液的制备”操作，并进行测定计算，结果见表3。

表3 猫爪草药材中穗花杉双黄酮的含量（n=3）

3 讨论

3.1 供试品溶液的制备：超声提取和加热回流提取为中药材有效成分含量测定中运用最多的两种提取方式，本文对超声提取和加热回流提取两种方式进行了比较，结果表明两种提取方式的提取效率相近，由于超声提取的操作更简单方便，本研究选择超声提取进行供试品溶液的制备。提取溶剂对提取效率的影响非常大，本研究对甲醇、乙醇、80%甲醇、80%乙醇、60%甲醇和60%乙醇对穗花杉双黄酮的提取效率进行了比较，结果表明甲醇对猫爪草中穗花杉双黄酮的提取效率最高，因此本研究选择甲醇作为提取溶剂。另外，本研究还对不同超声提取时间进行了比较，结果表明，超声提取30分钟后，随着提取时间的延长，并不能提高提取效率，故认为超声提取30分钟已能将穗花杉双黄酮提取完全，因此确定提取时间为30分钟。

3.2 色谱条件：本研究对各种色谱柱对穗花杉双黄酮的分离进行了比较，采用依利特Hypersil DBS C18（5μm，4.6mm×250mm）、COSMOSIL（5μm，4.6mm×250mm）、Agilent ZORBAX SB-C18（5μm，4.6mm×250mm）、YMC-pack ODS-A（5μm，4.6mm×250mm）、Thermo Hypersil GOLD（5μm，4.6mm× 250mm）、SUPELCO C18（5μm，4.6mm×250mm）等6种色谱柱进行实验，结果表明，穗花杉双黄酮在这六种色谱柱上都能得到较好的分离。本研究还对流动相系统进行了考察，比较了甲醇-磷酸系统和乙腈-磷酸系统，结果表明这两种流动相系统都能对穗花杉双黄酮进行较好的分离。

3.3 与现有的猫爪草质量控制方法比较：猫爪草为《中国药典》2015年版一部收录的品种，对其质量控制主要是通过性状鉴别、显微鉴别和薄层鉴别进行，缺乏定量控制方法。有学者对猫爪草中成分的定量分析进行了研究，吴晓等对猫爪草中的总糖、多糖含量进行了测定[9]，池玉梅等以芦丁为对照品对猫爪草药材中总黄酮的含量进行了测定[10]，还有学者对猫爪草的挥发性成分进行了分析[11]。但上述研究均未对代表猫爪草生理活性的单一成分进行研究。本文对猫爪草中穗花杉双黄酮的含量进行测定，并建立了含量测定方法，可以为猫爪草的质量控制指标的确定提供一定的参考。