裂解温度和时间对MCF-7细胞电化学行为的影响

乔勇昌， 崔雨薇，郭 爽，王可欣，熊 飞，崔继文，王书红

(1.佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学外国语学院，黑龙江 佳木斯 154007)

细胞电化学因其简单快速、灵敏度高、成本低、无污染、细胞样品可重复使用等特点而广泛应用于体外抗肿瘤药物筛选和环境致癌物毒性评价等领域[1～8]。电化学法在评价细胞活性和抗癌药物敏感性时主要依据细胞中嘌呤碱基的电化学信号，而传统加热方法裂解细胞得到的嘌呤碱基含量偏低，导致检测出的电化学信号偏弱，这严重影响了对细胞活性评价和抗癌药物筛选的可靠性。为解决这个问题，本课题组建立了一种新的细胞前处理方式-复合裂解，即在加热裂解细胞的基础上，引入低渗效应，以增加细胞裂解液中嘌呤碱基的含量，这样做不仅会提高细胞中的嘌呤碱基的电化学信号，尤其是腺嘌呤的电化学信号，同时还可提高肿瘤细胞的最低浓度检测下限。检测时裂解温度和时间的优化对所检测到的电化学信号的强弱有重要影响，因此本文以人乳腺癌细胞(MCF-7)为模型细胞，采用单线循环伏安法作为电化学检测方法，对复合裂解的温度和时间对电化学信号的影响进行研究，为以后把这种新的细胞前处理方式-复合裂解应用于评价细胞活性和筛选抗癌药物研究提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

CHI760E型电化学工作站(上海辰华仪器公司)；ES-250J电子分析天平(沈阳龙腾电子称量仪器有限公司)；HF90型二氧化碳培养箱(上海力申科学仪器有限公司)；德国brand移液枪(德国莱茵集团有限公司)；离子液体(IL，bmim-PF6)(美国百灵威公司)；多壁碳纳米管(MWCNT)(深圳纳米港有限公司)；MCF-7细胞(美国Hyclone公司)；DMEM培养基(美国Hyclone公司)；优级胎牛血清(美国Gibco公司)；链霉素和青霉素(美国Gibco公司)，除特殊说明外，所有试剂均为分析纯[9,10]。

1.2 复合修饰电极的制备

称取酸化好的多壁碳纳米管(MWCNT)2mg，放于玛瑙研钵中研磨精细，至少研磨0.5h以上，再量取离子液体40 μL，分次加入到研钵中，继续研磨成黑色的浆糊状的均匀黏液，得到多壁碳纳米管-离子液体(MWCNT-IL)备用。

将3mm的玻碳电极(GCE)采用直径为0.5μm和0.05μm的氧化铝粉末进行抛光后，使用铁氰化钾溶液进行电化学检测，验证其光滑度，用乙醇和双蒸水依次超声各1 min后，置于室内晾干备用。蘸取少量的研磨均匀的多壁碳纳米管-离子液体轻轻均匀的擦涂在玻碳电极表面，即得多壁碳纳米管-离子液体修饰的玻碳电极(MWCNT-IL/GCE)。将涂抹好的MWCNT-IL/GCE放在pH 7.4 PBS缓冲溶液中，在0.0～+1.1V范围内循环伏安扫描若干圈至背景完全重叠后即电极达到稳定状态为止，然后室温放置备用即可。使用该修饰电极进行样品检测的电位窗为0.0～+1.2V，室温条件下进行。

1.3 细胞的培养与收集

MCF-7 细胞使用DMEM培养液培养，于37℃、5% CO2培养箱中进行生长。当细胞贴壁至培养皿的80%时，拿出培养皿，倒掉培养液，加入pH 7.4 PBS冲洗三次后，用胰蛋白酶进行消化，加入培养液后，均分到不同的培养皿中，吹打均匀后放回到37℃、5% CO2培养箱中继续培养。

1.4 电化学检测

实验中以Pt丝电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，多壁碳纳米管-离子液体复合修饰的玻碳电极(MWCNT-IL/GCE)为工作电极，制成三电极体系电化学测试系统。将细胞进行裂解后，然后采用单线扫描伏安法进行检测，电位窗设为0.0 ～+1.2V，扫速为0.05Vs-1，检测得到的实验数据，使用Origin 6.0软件处理。把生长状态良好且长满培养皿底的细胞，用pH 7.4 PBS冲洗三次，消化，离心，加入双蒸水(DDW)调至浓度为5×106cells mL-1，将所得的细胞溶液分别放于37℃、45℃、50℃、55℃、60℃和65℃的水浴锅中30min后，取出细胞悬液，吹打均匀后，立即用修饰好的MWCNT-IL/GCE电极分别测定其电化学信号，探究最佳裂解温度。选取消化离心后的细胞沉淀加入DDW调至浓度为1×106cells mL-1，将所得的细胞溶液放置于50℃的水浴锅中，分别在放置10min、20min、30min、40min、50min和60min后，取出细胞悬液，吹打均匀后，立即用修饰好的MWCNT-IL/GCE电极分别测定其电化学信号，探究最佳的裂解时间。

2 结果

2.1 不同裂解温度对细胞电化学行为的影响

不同温度下MCF-7细胞悬浮裂解液的单线扫描结果如图1所示，从图中可看出，第一个电化学信号的峰位置出现在0.720V左右，该峰是鸟嘌呤(G)和黄嘌呤(X)的混合氧化峰，在37～60℃氧化峰(peak area)的数值随温度升高先增大后减小，在50℃时氧化峰值最大，电化学信号最强；第二个电化学信号的峰位置在1.067V左右，该峰是腺嘌呤(A)和次黄嘌呤(HX)的混合氧化峰，在37～65℃氧化峰的数值(peak area)随温度升高先增大后减小，在55℃时氧化峰值最大，电化学信号最强。尽管两个不同峰位置的电化学信号最高值不同，但是二者随温度的变化趋势是一样的。这说明可能随着温度的升高，细胞的裂解程度增大，更容易释放电活性物质，但温度过高可能会造成嘌呤碱基活性物质遭到破坏。结合Ⅰ、Ⅱ两个电化学信号峰值，可以得出实验温度在50℃时，所获得电化学信号是最好的，所以确定实验的最佳裂解温度是50℃。

图1 基线校正后的细胞在不同温度下的单线扫描曲线

2.2 不同裂解时间对细胞电化学行为的影响

裂解不同时间MCF-7细胞悬浮裂解液的单线扫描结果如图2所示，从图中可看出，第一个电化学信号的峰位置在0.713V左右，该峰是鸟嘌呤(G)和黄嘌呤(X)的混合氧化峰，在10～60min氧化峰(peak area)的数值随时间延长先增大后减小，在实验时间是50min时，峰值最大，所获得的电化学信号最强；第二个电化学信号的峰位置在1.062V左右，该峰是腺嘌呤(A)和次黄嘌呤(HX)的混合氧化峰，在10～60min氧化峰(peak area)的峰值随时间延长先增大后减小，当实验时间是30min时，峰值最大，所获得的电化学信号最强。两个氧化峰的峰值都随时间的延长呈现先增加后减小的趋势，说明随着裂解时间的增加，细胞释放的电活性物质增多，但时间太久，有可能导致细胞在裂解过程中细胞内的化学物质发生相互反应[10]，或者长时间在一定温度下进行裂解破坏细胞电活性物质。结合Ⅰ、Ⅱ两个电化学信号峰值，30min时所获得的电化学信号最强，所以确定实验的最佳裂解时间为30min。

图2 基线校正后的细胞在不同裂解时间的单线扫描曲线

3 讨论

电化学分析法是近几年新兴的实验方法，与传统方法相比，具有分析速度快、灵敏度高、操作简单及成本低等优点，但其检测依赖于所用电极的敏感性、细胞前处理方式以及细胞的最低浓度，一般情况下，需要较高浓度的细胞才能保证获得稳定的信号。本文目的在于探究优化一种新的细胞前处理方式-原位复合裂解，以增加细胞中嘌呤碱基的的释放，提高细胞中嘌呤碱基的电化学信号，降低细胞电化学检测的最低浓度下限。不同的裂解温度和裂解时间，对细胞内的电活性物质含量均有较大的影响，因而导致在不同条件下测得的电化学信号强弱不同，我们对比分析了裂解温度和裂解时间对细胞裂解液电化学信号的影响，结果表明在裂解温度为50 ℃，裂解时间为30 min时，可以获得最强的电化学信号，该裂解条件可以更加真实地反映细胞内电活性物质的实际含量，有利于更进一步提高细胞电化学检测的灵敏度，因而可以作为细胞进行电化学检测的最佳裂解条件，该研究成果可以为细胞中嘌呤碱基的定量探究提供理论依据，为电化学方法在与嘌呤碱基的相关的检测中获得实际应用奠定了坚实的基础。