益气活血通阳法不同配比促兔缺血心肌血管新生作用的研究

温志浩，卢健棋，潘朝锌，何新兵，王庆高，黄明剑，彭志林，庞 延，周宇桢，黄舒培

目前我国冠心病的一级和二级预防还做得远远不够[1]，很多病人在确诊冠心病时冠状动脉病变已经非常严重，弥漫病变和多支病变不在少数，丧失了介入治疗或手术治疗的时机，现有药物治疗亦无法有效改善心肌缺血，成为目前治疗的难点。此外，目前介入治疗费用较高，很多病人难以负担。基于我国国情，找到一种既能有效改善病人症状和预后，又能获得较高卫生经济学收益的办法是非常有必要的。目前的研究重点集中在刺激缺血心肌血管生成方面，即促进冠状动脉侧支循环建立，改善缺血心肌血供。不过目前存在促血管新生作用不理想及血管新生相关副作用的研究瓶颈[2]。中医辨证论治在促血管新生方面具有一定的优势，临床研究认为气虚、阳虚、血瘀是引起冠心病发生发展的重要因素，既往的研究也提示益气、通阳、活血药对促血管新生有独特的作用[3-4]。基于此，本研究旨在利用高脂饮食和冠状动脉结扎法造成兔动脉粥样硬化和急性心肌梗死双模型[5]，观察不同组方的安心颗粒对急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)兔梗死边缘区心肌微血管密度的影响，并同步测定动脉粥样硬化斑块内新生血管密度等副反应指标，从整体和微观层次来阐述益气活血通阳法对心肌梗死兔心脏的促血管新生作用及其副反应的发生情况，为益气活血通阳法促进缺血心肌血管新生提供科学依据，并为平衡促血管新生作用和血管新生相关副反应提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取健康雄性新西兰兔50只，2月龄，体重2.7～3.0 kg，购自广西医科大学动物实验中心，动物合格证编号：45000300000676，许可证编号：scxk(桂)2014-0002。

1.2 主要实验试剂及仪器 Envision试剂(HRP/Rabbit)即用型(Dako，丹麦)；CD34单克隆抗体(santacruz，美国)；医学图像分析软件(申腾信息技术有限公司，上海)。

1.3 方法

1.3.1 动物模型制备

1.3.1.1 复制动脉粥样硬化动物模型 健康雄性新西兰兔50只，按体重随机编入各组，每组5只。单笼饲养，第1周先予普通饲料喂养，以适应周围环境。后给予高脂饮食喂养，每只150 g/d，连续喂养8周，复制动脉粥样硬化动物模型。

1.3.1.2 复制急性心肌梗死和动脉粥样硬化动物双模型 随机选取高脂饮食第2周末的动物，用3%戊巴比妥钠30 mg/kg注入耳缘静脉麻醉后仰卧位固定在兔台上，气管插管连接小动物呼吸机，胸前区备皮、消毒、铺巾，沿左胸骨旁线划开皮肤后逐层钝性分离组织，分离至肋骨层面后在胸骨旁线处剪断第2、3肋骨，撑开器充分暴露视野，找到纵隔后小心剪开心包，将心包固定在胸壁上，找到心脏前室间沟，用3号外科缝线于前室间沟上1/3处结扎前降支血管，结扎远端心肌颜色由淡红变苍白，搏动幅度减弱，30 min后剪断结扎线，逐层关闭胸腔，待动物恢复自主呼吸，拔除气管插管，肌内注射青霉素预防感染。术后第3天沿原开口开胸，观察见心脏较前变大，搏动明显减弱，取出心脏，固定后行病理切片HE染色。显示急性心肌梗死复制成功。

1.3.2 给药方案 安心颗粒组方：红参10 g，水蛭10 g，桂枝12 g，瓜蒌壳12 g，茯苓10 g等。红参、水蛭用乙醇提取，其余药物用水提取。参考基线等比增减设计法，按照7种比例(10∶0、10∶4、10∶7、10∶10、7∶10、4∶10、0∶10)称取红参、水蛭，按照前期经过正交试验设计得到的最佳提取方案进行提取，即70%乙醇提取，每次提取1.5 h，提取3次，每次10倍量乙醇，合并乙醇提取液，回收乙醇至尽，置于蒸发皿中水浴浓缩，合并水提部分，定容后备用；安心颗粒连续给药10周，给药剂量按兔与人体表面积折合换算。

1.3.3 实验分组 空白组：正常饮食，予生理盐水灌胃。假手术组：正常饮食，只开胸穿线，不结扎左冠状动脉前降支，术后给予生理盐水灌胃。模型组：高脂饮食，行结扎前降支术后给予生理盐水灌胃。西药对照组：于开胸结扎冠状动脉后立即在结扎处周围喷洒碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。中药组：亚组1～亚组7术后分别给予红参/水蛭比例为10∶0、10∶4、10∶7、10∶10、7∶10、4∶10、0∶10的安心颗粒灌胃液。

1.4 取材 缺血心肌标本取材：将心脏沿短轴水平横切，于梗死边缘区切取组织标本，置入10%中性甲醛中固定24 h，常规石蜡包埋。动脉标本取材：取胸主动脉横截取材，常规固定包埋。

1.5 检测 采用En Vision法[6]行CD34免疫组化染色测定CD34阳性反应强度及新生血管密度，阳性反应强度=阳性反应面积/平均光密度。染色呈棕黄色为阳性，参照Kaku等[7]介绍的方法，在低倍镜下选择CD34标记的新生血管密度高的区域，100倍镜下计数3个视野，取其平均值，管腔>8个红细胞直径的血管不计在内。

2 结 果

2.1 各组心肌组织不同区域新生血管密度比较 模型组和西药对照组缺血心肌区新生血管密度大于梗死心肌区和正常心肌区(P<0.05)；在缺血心肌区，红参与水蛭比例10∶4组与西药对照组新生血管密度比较差异无统计学意义(P>0.05)，优于其他比例中药组及模型组(P<0.05)，说明红参、水蛭比例为10∶4能够更有效地促进缺血心肌区的血管新生。详见表1。

表1 各组心肌组织不同区域新生血管密度比较 (±s) 单位：根/mm2

2.2 各组心肌组织不同区域CD34阳性反应强度比较 模型组和各用药组缺血心肌区CD34阳性反应强度大于梗死心肌区和正常心肌区(P<0.05)，说明缺血心肌区的血管新生密度较为密集。在缺血心肌区，红参与水蛭比例10∶4组与西药对照组CD34阳性反应强度比较差异无统计学意义(P>0.05)，10∶4中药组与西药对照组优于模型组(P<0.05)。详见表2。

表2 各组心肌组织不同区域CD34阳性反应强度比较 (±s)

2.3 各组主动脉壁区CD34阳性反应强度比较 各组主动脉壁区CD34阳性反应强度比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表3。

表3 各组第10周主动脉CD34阳性反应强度比较 (±s)

3 讨 论

近年来，冠心病在我国的发病率呈逐渐升高态势[8]。随着冠心病发病年龄的年轻化，其造成的社会经济和卫生负担也越来越大。由此，冠心病的治疗受到了国内外的广泛关注。临床治疗指南不断推出和更新，血运重建治疗技术不断发展，但基于我国目前国情，许多病人仍难以承受介入治疗的药物及器械相关费用，且部分病人由于血管条件或基础病等原因无法实行介入或冠状动脉搭桥等血运重建治疗。因此，寻求更为经济的冠心病血运修复策略是临床实践迫切需要的。

基于上述认识，采取了包括蛋白治疗、基因治疗、细胞治疗和联合治疗等方法以实现治疗性血管再生[2]，关于血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factors，VEGFs)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors，FGFs)和内皮祖细胞等研究日益增多。目前虽然很多一期试验得到了肯定的结论[9]，但近年的二期临床试验却没有得到阳性结果[10]，且还暴露了包括促动脉狭窄、形成不稳定斑块、促肿瘤生长、视网膜增生等多种副作用[11]。有科学家就此提出了“Janus Phenomenon”的概念，即具有促血管新生作用的药物同样具有加重动脉粥样硬化的作用[12]，这是治疗上广受关注的一个矛盾点。故寻找具有肯定促血管新生作用而没有相关副作用的药物，已经成为当今心血管研究的重大课题。

益气通阳、活血通脉成为冠心病的重要治疗法则。而进一步的研究发现，这些治疗方法对血管新生的多个环节均有作用。有研究显示：人参、三七提取物可促进血管生成信号通路上VEGF R-2的表达[13]；而复方芪丹液则被发现能够持续上调促VEGF、bFGF的基因与蛋白的表达，提高缺血心肌毛细血管密度[14]。近年来，许多实验研究证明，活血化瘀法能通过调节血脂代谢、抑制血管平滑肌增生和迁移、保护血管内皮细胞等多个环节发挥减轻动脉粥样硬化病变和稳定斑块的作用[15-16]。由此，通过益气药和活血药的合理配伍，可能会为“Janus Phenomenon”提供解决方案。

安心颗粒是全国名老中医方显明教授研制的验方，已于临床上应用多年，由人参、桂枝、瓜蒌、水蛭、茯苓等中药制成，方中人参大补元气、安神益心为君；桂枝通阳行脉、助阳化气，为臣药；水蛭活血逐瘀、通脉散结；瓜蒌理气宽胸、化痰泄浊，同为佐药；茯苓益心、脾，宁心安神，为使药。诸药合用共奏甘温益气、活血通阳之功效。前期研究表明，安心颗粒可明确改善心肌缺血症状，减少冠心病介入术后不良心血管事件的发生[17]。实验研究则提示安心颗粒对大鼠心肌缺血再灌注损伤有显著的保护作用[18]，并可抑制粥样硬化斑块形成[19]。现代药理研究表明，人参皂苷Rgl可动员骨髓干细胞归巢于缺血心肌，有效促进微血管形成，通过上调VEGF及其受体的表达，促进血管再生，促进缺血心脏功能恢复[20]；瓜蒌能扩张冠状动脉，改善心肌缺血状态。此外，另有研究显示，水蛭不仅可以促进血管新生[21]，也可降低经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术后再狭窄发生率[22]。

本实验研究利用高脂饮食和冠状动脉结扎法造成兔动脉粥样硬化和急性心肌梗死双模型，观察不同组方的安心颗粒对急性心肌梗死兔梗死边缘区心肌新生微血管密度的影响，并同步测定动脉粥样硬化斑块内CD34反应强度等副反应指标，结果提示，安心颗粒中药干预组中，红参与水蛭比例为10∶4中药组可显著增加缺血心肌区新生血管密度，10∶4中药组CD34阳性反应强度显著高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，与西药对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。而同时在主动脉壁区CD34反应强度未见升高。故考虑益气活血药物的合理配比可促进梗死边缘区血管新生，同时未见导致动脉斑块内血管新生的副作用。